加载中…pGEM-T和pGEM-T Easy载体一些常见问题
(2013-05-19 18:37:40)
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pgem-teasy载体pcr产物克隆promega生命科学it |
分类： pcr技术 |
1) 什么是pGEM-T和pGEM-T Easy载体系统？
pGEM-T和pGEM-T Easy载体系统用于PCR产物的直接克隆。其中包括pGEM-T对照DNA，T4 DNA 连接酶，2X快速连接液，和pGEM-T或pGEM-T Easy载体。载体线经性化，3`末端带有T单核苷酸。
2)
什么是pGEM-T和pGEM-T Easy载体的差别？
两载体的唯一差别是多克隆位点不同。pGEM-T
Easy载体的多克隆位点在插入序列的两端带有
有些耐热的DNA聚合酶在3`末端加上单个脱氧核苷酸，通常是单A。pGEM-T和pGEM-T Easy载体利用了这一结果。载体经
各种耐热聚合酶产生的3`末端情况各异。有修复功能（3`-5`外切核酸酶活力）的聚合酶产生平末端PCR产物，无修复功能聚合酶产生3`-A的PCR产物。具体情况见下表：
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Taq：DNA末端 3`-A，有5`-3`外切核酸酶活力，没有3`-5`外切核酸酶活力
Tf1： DNA末端 3`-A，有5`-3`外切核酸酶活力，没有3`-5`外切核酸酶活力
Tth： DNA末端 3`-A，有5`-3`外切核酸酶活力，没有3`-5`外切核酸酶活力
Tli： DNA末端>95%平头，没有5`-3`外切核酸酶活力，有3`-5`外切核酸酶活力
Deep(VENT?/sup)： DNA末端>95%平头，没有5`-3`外切核酸酶活力，有3`-5`外切核酸酶活力
Pfu： DNA末端平头，没有5`-3`外切核酸酶活力，有3`-5`外切核酸酶活力
Pwo (VENT?/sup)： DNA末端未测，没有5`-3`外切核酸酶活力，有3`-5`外切核酸酶活力
``Long PCR''Enzyme Mixes：
DNA末端可变，有5`-3`外切核酸酶活力，有3`-5`外切核酸酶活力
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Long PCR Enzyme
Mixes含有修复功能的酶（切除3`-A）和无修复功能的酶（加3`-A）。加A的效率取决于特定酶混合。
先用蓝/白斑菌落作初筛。可进一步用限制性酶切和小规模PCR分析。
蓝/白斑菌落筛选的基础是阻断
实验结果无法预知。但用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，再其中的80%应带有pGEM-T正对照。
所有Promega公司的T4连接酶均作了核酸酶污染测定。其它来源的连接酶可能会带有外切核酸酶，或其它污染会除去末端碱基，使非重组子的背景高。
最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4oC过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
A）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：
1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4oC过夜。
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞。
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