生命的遗传信息存储于 DNA序列之中,高等生物每一个细胞的全部DNA构成了该生物体的基因组。基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础。尽管在生命信息的传递过程中DNA能够精确地自我复制,但是许多因素也能引起DNA序列的变化,造成个体之间的遗传差异。单个碱基的替换、DNA片段的插入、缺失、易位和倒位等都能引起
DNA序列的变异。
利用现代分子生物学技术揭示DNA序列的变异(遗传多态性),就可以建立DNA水平上的遗传标记。从1980年人类遗传学J.G.K.Botstein等首次提出DNA限制性片段长度多态性作为遗传标记的思想及1985年PCR技术的诞生至今,已经发展了十多种基于DNA多态性的分子标记技术,这些DNA标记技术综合起来可分为以DNA杂交为基础的和以PCR为基础的以及PCR技术和限制性酶切技术相结合的几种类型。显然,检测DNA水平上的遗传变异最精确的方法是直接测定
DNA序列,通过对测定的
DNA序列进行分析比较,即可揭示生物体间在单个核苷酸水平上的遗传多态性。基于这一原理,最近发展了SNP标记,即单核苷酸多态性标记,应用前景十分美好。
依据对DNA多态性的检测手段,DNA标记可分为四大类:
第一类为基于DNA-DNA杂交的DNA标记。主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction
Fragment Length
Polymorphism, RFLP)、可变数目串联重复序列标记(Variable
Number of Tandem
Repeats, VNTR)、单链构象多态性RFLP(Single-Strand
Conformation Polymorphism-RFLP, SSCP-RFLP)等;
第二类为基于PCR的DNA标记。主要有随机扩增多态性DNA(Randomly
Amplified Polymorphic
DNA, RAPD),简单重复序列(Simple
Sequence Repeats, SSR),简单序列重复间区(Inter
Simple Sequence Repeats, ISSR),测定序列标签位点(Sequence
Tagged Site, STS),表达序列标签(Expressed
Sequence Tag, EST),特征性片段扩增区域(Sequence
Characterized Amplified
Region, SCAR);
第三类为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记。主要有两种,一种是扩增片段长度多态性(Amplified
Fragment Length
Polymorohism, AFLP),第二种是酶解扩增多态顺序(Cleaved
Amplified Polymorphic
sequence, CAPS);
第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记。主要是单核苷酸酸多态性(Single
Nucleotide
Polymorphism, SNP)。
各类常用分子标记的特点和应用如下:
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标记名称
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引物设计方法
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特点
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应用
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多态性原因
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RAPD
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以几个随机寡核苷酸(常用10个)为引物
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简便、易行、灵敏、安全性好、DNA用量少,能快速进行基因多态性研究,但重复性较差
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遗传资源保存、遗传多样性研究、种质资源鉴定、遗传资源分类、品种纯度鉴定、遗传图谱的构建、突变检测、基因标记和基因组比较
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多态性是由于引物与不同区段的同源序列结合,产生不同的DNA产物
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RFLP
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以单拷贝或低拷贝的 DNA克隆(基因组DNA或cDNA)作探针
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共显性、信息完整、稳定性和重复性好
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品种鉴别和品系纯度鉴定、分子标记连锁图谱构建、基因定位、种质鉴定和遗传背景分析、遗传多样性分析
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多态性主要是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA序列单碱基的替换、DNA片段的插入、缺失、易位和倒位等引起
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SSR
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两端序列较保守, SSR引物根据与微卫星重复序两端的特定短序列设计,用来扩增重复序列本身,从而揭示微卫星的多态性。
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共显性、信息完整、稳定性重复性好,操作简单
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生物遗传作图、基因定位、群体遗传研究、个体间亲缘关系鉴定
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多态性是由于SSR座位的基本单元重复次数的小同而形成
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SNP
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DNA测序中碱基的峰高和面积变化,已有
DNA序列比较,设计特定区域DNA片段的特异PCR引物,扩增相应DNA片段并进行序列比较
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SNP的数量极其丰富,并且可以进行自动化检
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适应于复杂性状的遗传分析、引起群体差异的基因识别
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多态性足由于单个核苷酸的变异所引起
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AFLP
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用两种能产生黏性末端的限制性内切酶将基因组DNA切割成分子量人小不等的限制性片段,然后将这些片段与其末端互补的已知序列的接头连接,所形成带接头的特异片段用作随后的PCR反应模版,PCR引物5’端与接头和酶切位点序列互补,3’端在酶切位点后增加1~3个选择性碱基
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不需预先知道DNA序列信息的情况下就可以同时进行多数DNA酶切片段的PCR扩增,既有RFLP的可靠性又有RAPD的方便性
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构建高密度的遗传连锁图,DNA指纹图谱构建
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多态性是由于酶切位点和其后的选择性碱基的变异
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SCAR
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根据RAPD或AFLP碱基序列设计特异引物
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克服了RAPD标记的不稳定性,AFLP标记的难操作性
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生物遗传作图、基因定位
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多态性是由于引物与不同区段的同源序列结合,产生不同的DNA产物
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CAPS
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适合于扩增产物的限制性内切酶
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是一些特异引物 PCR标记的延伸
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适应于性状连锁标记的发掘
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多态性是由于特异PCR产物DNA序列内限制性晦切位点变异
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