本实验室现开放分子生物学技术平台，对广大科研工作者提供实时荧光定量PCR技术服务，收费标准暂订为120/样本。有需要的同学请来电或在线咨询。

   实时荧光PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于应用了荧光探针，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。而实时荧光-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端从而可以快速以及动态地检测PCR扩增产物并减少外来核酸造成的污染。

   实时荧光PCR技术基于荧光共振能量迁移（FRET，Fluorescent Resonance Energy Transfer）原理：当两个荧光基团靠近时，高能量荧光基团会将受激发产生的能量转移到相临的低能量荧光基团上。由于标记在探针上的两种荧光基团所发出荧光信号的变化可以反映PCR扩增产物的数量变化，从而使得荧光PCR技术可以起到实时检测的目的。目前，根据荧光基团在寡核苷酸探针上的不同标记形式，各种荧光PCR检测试剂盒所采用的荧光探针基本可以分为三种类型：Taqman探针、分子信标和荧光杂交探针。

http://s15/mw690/002ZF4cqgy6HdJG4DWm5e&690

http://s5/mw690/002ZF4cqgy6HdJHfUpK74&690

引物设计原则

* 序列选取应在基因的保守区段
* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
* Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
* 引物之间的TM相差避免超过2℃
* 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
* 为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
* Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp
* 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。 　

探针设计原则

* 探针位置尽可能地靠近上游引物
* 探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性
* 检测探针的DNA折叠和二级结构
* Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%
* 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤――因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
* 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量――G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
* 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。