做RT-PCR前标本的处理方法：-80°冰箱，液氮冻存可达到-150°，提RNA前不需要复苏细胞，保存的细胞存放几个月没问题。

总RNA提取

1. 取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4. 12000×g，4℃ 离心，15min。

5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7. 12000×g，4℃ 离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀

8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。

9. 7500×g，4℃ 离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μl DEPC水，取1μl加入79μl DEPC水测OD260/OD280

12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
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逆转录合成 cDNA

反应体系如下
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混匀快速离心一次

反应条件如下
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-20℃ 冰箱冻存

PCR反应

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混匀快速离心一次

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PCR产物-20℃冰箱保存

取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V

100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果

两步法与一步法RT-PCR比较
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