加载中…
个人资料
上海流式细胞检测服务
上海流式细胞检测服务
  • 博客等级:
  • 博客积分:0
  • 博客访问:6,312
  • 关注人气:126
  • 获赠金笔:0支
  • 赠出金笔:0支
  • 荣誉徽章:
正文 字体大小:

做WB时应如何直接保存细胞样品?

(2012-12-31 19:20:54)
标签:

wb

细胞样品

技术服务

实验室

杂谈

分类: Westernblot

  如果是纯粹的蛋白研究都可以.在-80度保存一两年都没问题,如果要研究蛋白质修饰的话.比如磷酸化蛋白在-80度保存个把月后会有很大一部分的pi丢失.

  在做磷酸化WB时,加药后孵育10min立即用预冷PBS洗去药物,然后冰上操作裂解细胞,裂解液也是预冷的,整个过程速度要快。加了裂解液冰上吹打30min,然后4度14000转离心30min,取上清,加sample buffer煮沸10min,-70保存长时间保存,如果短期内做可以-20保存。这就是磷酸化蛋白处理过程。

  以下是来自网络的各个样本的保存方法:

1、悬浮细胞样品:把细胞及培养液一起收集到15ml或者50ml离心管中,1500rpm离心3min,弃去上清;加入PBS轻轻吹打,1500rpm离心3min,弃去上清;反复3次,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。
2、贴壁细胞样品:
2.1 胰酶消化:用胰酶将细胞消化后,收集到15ml或者50ml离心管中,1500rpm离心3min,弃去上清;加入PBS轻轻吹打,1500rpm离心3min,弃去上清;反复3次,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。
2.2 细胞刮子收集细胞:对于某些蛋白(即对胰酶比较敏感或者实验特殊要求,如E-Cadherin不易用胰酶消化后进行WB检测),直接用细胞刮子刮下细胞,收集到EP、15ml或者50ml离心管中,1500rpm离心3min,弃去上清;加入PBS轻轻吹打,1500rpm离心3min,弃去上清;反复3次,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。
3、动物组织样品:取下合适的动物或者人的组织样品后用预冷的PBS或者生理盐水漂洗,尽量除尽残留血液,用滤纸把多余PBS吸取干净。把组织分成约50mg大小(依据实验目的需要进行调整),用锡纸分别包装好或者用冻存管装好,于-80度或者液氮中保存。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。
4、植物样品:取得待测植物样品后,用蒸馏水把泥土漂洗干净,用滤纸把多余水分吸取干净,分装成合适大小于-80度或者液氮中保存。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。
5、细菌样品:细菌培养完成后,10000rpm离心5min收集细菌,加入PBS吹打,10000rpm离心5min,弃去上清;反复3次,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。
6、若要检测磷酸化蛋白,请在3个月内进行。长时间保存样品容易使磷酸化蛋白去磷酸化而检测不到磷酸化条带。
7、提取胞浆、胞核蛋白的样品应尽量采用新鲜样品,冻存样品提取的胞核蛋白可能会减少。
8、血液样品(血浆中蛋白):3000rpm离心20min后收集上清,分装后于-80度或者液氮冻存待用。3个月以内检测。
9、长距离运送样品时采用干冰或者液氮。
样品的实际需要量及WB技术服务请打电话咨询。


 

0

阅读 收藏 喜欢 打印举报/Report
  

新浪BLOG意见反馈留言板 欢迎批评指正

新浪简介 | About Sina | 广告服务 | 联系我们 | 招聘信息 | 网站律师 | SINA English | 产品答疑

新浪公司 版权所有