流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群、人类白细胞抗原B27(HLA-B27)的条件,确定流式细胞术检测T淋巴细胞亚群及HLA-B27样品的有效保存时间。方法：采集健康人外周血,将标记荧光抗体的样品用2%甲醛固定并保存于4 ℃冰箱,于不同时间进行检测.结果 固定样品保存至第9天,辅助性T淋巴细胞(CD4+)、抑制性/细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)、CD4+CD8+细胞数下降差异有统计学意义(P<0.05),而HLA-B27细胞数变化差异无统计学意义(P>0.05).结论 固定样本4 ℃的在8 d内检测T淋巴细胞亚群及12 d内检测HLA-B27结果 差异无统计学意义,这对于临床诊断和基础研究具有很大的实际意义。

流式细胞仪常用的几种检测方法

一、测定用乙醇固定的DNA的含量

1、培养细胞的DNA含量的测定

制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中；

加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存；

 附:细胞固定的一般步骤

1)        取单细胞悬液1～2×10⁶个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；

2)        300g离心5分钟，弃上清，反复两次；

3)        重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中；

4)        将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分钟。在4℃条件下可保存2~3周。

 注意：

²       根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛；

²       将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃；

²       细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。

²       300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中；

²       显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤；

²       加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟；

²       上机检测。

2、新鲜组织的DNA含量的测定

1)        用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液；

2)        500g离心5分钟；

3)        弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中；

4)        再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤；

5)        上机检测。

3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定

1)        从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液；

2)        用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清；

3)        加入PI液1ml室温避光30分钟；

4)        调整细胞浓度为1×10⁶/ml；

5)        上机检测。