普通植物病理学实验指导（下册）

    实验四  真菌孢子的萌发

    一、实验目的
    欲了解病菌生活力的强弱，生存期的长短，有效传播距离，抗药性的大小，生活史，环境与发病的关系以及有些病菌的种类鉴定等，都必须进行孢子萌发试验。孢子能否萌发，萌发率的高低，萌发势的强弱以及萌发的方式等既受病菌自身内在的因素影响，也受外界环境条件制约，因此要达到萌发试验的目的，必须充分掌握萌发所需的各种条件，本次实验主要学习孢子萌发常用的方法，同时通过实验理解各种孢子萌发所需条件不同。

    二、内容、材料和方法
    孢子萌发的方法很多，有些真菌的孢子须用特殊的方法才能萌发，以下仅实验常用的方法。
    (一)悬滴法
    1材料：玉米大斑病菌斜面菌种。
    2方法：在洁净的盖玻片中央滴玉米大斑病菌孢子悬浮液一滴，注意滴成圆形，大小适当，菌悬液浓度以显微镜低倍镜头每个视野约20个孢子为宜。然后翻转盖片制成悬滴，并封闭在特制的玻环内，再将玻环放在底部盛少许水的培养皿中，盖好皿盖，放置在26—28℃温箱中培养，4—5小时后检查萌发结果。
    此法也可改用直接用培养皿盖的里面作悬滴进行，即用玻璃笔在皿盖里面划方格，在方格中央滴孢子悬液，然后慢慢转皿盖。盖在盛有少量蒸馏水的皿底上，保温保湿培养，此法的优点是简便，而且适用于大量孢子萌发测定。

    (二)液滴法
    1.材料：小麦根腐病菌斜面菌种。
    2.方法：在培养皿内放一“井”字或“U”形玻璃棒，皿底加蒸馏水少许或衬上吸水纸或加几个脱脂棉球吸水保湿，玻璃棒上放载玻片，其上分别滴2或3滴小麦根腐病菌孢子悬浮液〔浓度同(一)〕，盖好皿盖，置于26—28℃温箱中培养，4—5小时后，镜检萌发结果。
    此法也可发展为将配好的孢子悬液直接加在培养皿中进行萌发，一般一个培养皿中加10毫升左右，不能太多，然后直接镜检萌发结果，优点是一次可测定大量孢子。

    (三)琼脂培养基法
    对于某些不适于直接在水滴中萌发的真菌可采用此法。
    1.材料：新采集的带有夏孢子堆的小麦秆锈病病叶或小麦白粉病病叶。
    2.方法：取洁净的载玻片，在熔化并冷至50℃左右的2%水琼脂培养基中沾一下，待凝成薄层后，去掉一面琼脂培养基，将有琼脂培养基的一面朝上，平放在培养皿的“U”形玻棒上，再将秆锈菌夏孢子或白粉菌的分生孢子轻轻弹落或涂抹在琼脂平面上。保温培养，麦秆锈菌夏孢子培养在20℃温度下，麦白粉病分生孢子培养在10—12℃下，24小时后镜检萌发结果。
    此法也可以直接在培养皿中做成的水琼脂平板上进行。

    (四)载片引湿法
    此法用于不适于直接在水滴中萌发的某些真菌。
    1.材料：玉米瘤黑粉病菌的黑粉孢子。
    2.方法：在培养皿中放一“V”或“U”形玻璃棒，其上放一载玻片，再取宽1厘米，长4厘米的滤纸条一个放在皿内。灭菌后皿底加少许灭菌水，将滤纸条横放在载玻片上，崩紧，两端拖入水中，吸滴水，再在纸上滴一滴玉米瘤黑粉病菌黑粉孢子悬浮液，盖上皿盖，在25℃温箱中培养，逐日检查萌发的结果。

    三、孢子萌发的记载方法
孢子萌发是先吸水膨胀，然后长出芽管，通常以芽管长度超过孢子直径一半(不是正圆形的孢子以短径为准)作为萌发标准，记载萌发的方法有以下几种。
    (一)萌发率

    即萌发一定时间后，随机取一定数目(至少500个)的孢子，检查萌发的孢子数，求出萌发百分率，如果用该法记录两种或几种不同处理时，要注意严格掌握检查时间。

    (二)萌发时间
    即测定孢子萌发达到一定萌发率所需时间。

    (三)芽管平均长度
    即测定一定数目已萌发孢子的芽管长度，求其平均值。
    此外，有些萌发试验，如药效测定等，还需注意记录芽管的宽度形状变化以及是否有分枝等。

    四、作业
    镜检玉米大斑病菌或小麦根腐病菌分生孢子的萌发率。

    五、思考题
    1孢子萌发在植病研究工作中有什么重要意义? 在作萌发试验时，特别要注意哪些问题?
    2几种孢子萌发方法各自适用于哪些真菌? 记载孢子萌发的方法有几种? 各种什么优缺点。

    附：植物病原真菌的显微计测
    植物病理学上的显微计测，主要是测量微生物的大小，如真菌的菌丝体、子实体和孢子的大小等，孢子的计测尤其重要。显微计测的方法很多，如接目测微尺法，显微绘图仪法，螺旋测微计法，放映计测法和镜台十字推进器法等，但最常用的是接目测微尺计测法。
    1接目测微尺简介
    接目测微尺是一个可装入目镜内刻有横隔的圆玻璃片，在显微镜下，隔间所代表的距离因显微镜放大倍数和镜筒的长短而不同。故须用镜台测微尺确定，镜台测微尺是大小形状和载玻片相似的一种特制玻片，中央有圆圈，圈中央刻有一尺，尺长为一毫米，分为10大格或100小格，每小格为1/100毫米或10微米。
    2准定接目测微尺的方法
    (1)将显微镜镜筒调节到固定的长度
    (2)将接目测微尺放在接目镜内，由镜头向下看，上面的格纹，应极清楚。
    (3)将镜台测微尺放在镜台上
    (4)先用低倍镜观察，凡两尺任何两线相符时，即记下每一尺上的格数，如此观察三次，计算接目测微尺每格的长度。
                 镜台测微尺       接目测微尺
     第一次观察     12格            25格
     第二次观察      6格            13格
     第三次观察     30格            64格
     合  计         48格           102格
    接目测微尺每格=10微米×48/102=4.7微米
    (5)用同样方法准定高倍镜下接目测微尺每格的长度。
    (6)准定数值只适用于准定的显微镜，换用其它显微镜或镜头和镜筒长度改变时，必须重新确定。
    3孢子计测数目及大小记载法
    一般量菌丝体的宽度，分生孢子梗的长和宽，子囊果，子囊、分生孢子器的大小可选其大者或小者各量5—6个，分生孢子选成熟而大小不同的各量20—30个，或随机量50个。
    记载方法：一般记载孢子大小的幅度，如8.0—12.0，小数点以后数字，大小在20μ以下的可将尾数去掉，进一位或改以0.5表示，如13.3μ可改为13.5μ或13.5μ；大小在20—75μ之间的无须有小数点，大小在75—100μ之间的可将尾数进为5或10。