全内反射显微镜（TIRFM）是单分子荧光观察用光学方法。有些生物物理学家已经使用该技术多年，有的则是刚刚开始探索这种多功能的机制研究现象在接口的界限。

http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-05-23/c78321bd9acff185f98b30f93e22d854.jpg

今天，技术日益普及与细胞生物学家和神经科学家用它来观察细胞膜荧光，部分是因为已经开发了新的膜专用染料。在过去，全内反射荧光显微镜难以执行由于显微镜设置的复杂性，以及达到可接受的图像的亮度的问题。本应用笔记讨论了最近开发的高数值孔径显微镜物镜，提高的TIRFM使得普及。

 

 

背景

奥林巴斯显微镜全内反射的一种光学现象，可以采用观察的边界处发生的事件。当光照射两个光的不同折射率的介质之间的界面，在大于临界角的角度入射的光进行全反射。

http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-05-23/2cc3c1cbd3dbbc0163d945e36b708127.jpg

角以外的全反射，电磁场的输入/反射光仍然到的z方向延伸。在此字段中的强度，通常被称为渐逝波，呈指数下降，它的影响延伸到所述第二介质（具有较低的折射率）只有几百纳米。内试样的渐逝场中的那部分可以被激发，发出荧光，因此可以看出或记录。这是本质的TIRFM（见图1）。

 

全反射的条件由下面的公式给出：

θ(c) = sin-1(n(2)/n(1)) where n(1) > n(2)

 

其中，n（1）的物镜的折射率，n（2）试样的折射率，θ（c）的临界角。这种情况是相同的，创建的倏逝波。

 

TIRFM的主要优点是渐逝波的穿透深度浅。只有非常接近试样表面的荧光分子受激发，创造一个非常薄的光学部分。渐逝场之外，荧光是最小的。（见图2）效应导致非常高的对比度，具有良好的信号噪声比的图像。

 

 

TIRFM仪器的光路

科学家已经开发出一些TIRFM技术的设置，其中以下类型常见的有：（1）与照明侧棱镜，以及（2）通过透镜照明（参见图3）。

http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-05-23/199bf91b87e63ea4e0b4d6f5c871b66d.jpg

1.设置棱镜。这种设置是很容易做到的，因为它需要显微镜，棱镜，激光，所有的组件都是现成的。此安装方法的缺点是，试样之间的棱镜和显微镜物镜定位的要求。

2.安装程序通过物镜的照明。此安装程序需要通过显微镜，激光被引入，并极大地受益于物镜的数值孔径（NA）> 1.4。试样必须位于玻璃盖的底表面上。制剂，面向远离物镜，访问，允许使用其他的仪器，如显微操作器，微分干涉对比（DIC）的照明光学系统，甚至扫描探针显微镜。

 

 

TIRFM物镜

奥林巴斯显微镜APO 100x/NA 1.65复消色差物镜（Olympus America Inc., Melville, NY）的数值孔径大大超过以前最高的数值孔径的物镜，即Plan APO 100x/NA 1.4（奥林巴斯美国公司）。活细胞通常具有的折射率在1.33和1.38之间。要实现全内反射，这样的样品必须被照射具有数值孔径大于1.38（表1）。条件的上述和下述列出的方程表达的：

数值孔径(NA) = n • sin(θ)

其中，NA是物镜的数值孔径，n是折射率，θ是二分之一的物镜孔径角。

TIR角度和最大角度为物镜

	N（1）	N（2）	全反射角度A（1） （NA）	最大角度（2） （NA）
NA 1.4	浸油 1.515	细胞 1.38	65.63° （1.38）	67.53° （1.40）
NA 1.65	浸入式液体 1.78	细胞 1.38	50.83° （1.38）	67.97° （1.65）

表1

 

激发光，必须通过通过镜头的大于1.38的数值孔径锥部。使用一个高性能的平场复消色差1.4数值孔径的物镜，一个非常小的部分镜头数值孔径（1.4 - 1.38 = 0.02）可以利用。虽然这是可能的，这是非常具有挑战性的照明激光对准。即使完美对齐，增加光的强度是困难的，因为微乎其微的数值孔径保证金。很明显，类似的APO 100x/1.65透镜有更大的数值孔径纬度（1.65 - 1.38 = 0.27），使其更容易引入的激发光通过物镜出射光瞳（图4和表1）。

http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-05-23/2ecb80993f5c7a629ec750f56a278288.jpg

为了维持的数值孔径，并实现了图像质量的物镜的能力，高折射率（浸没液体[Cargille实验室，雪松树丛，NJ]：n（d）= 1.78），必须使用一种特殊的液浸介质。（这是挥发性的，并应处理使用好实验室工业实践）。

 

 

此外，玻璃盖必须具有较高的折射率（n（d）= 1.788;奥林巴斯显微镜美国公司），但是其制造的非常低的音量使得它比较昂贵的。

 

 

其他应用程序

该镜头具有其他应用程序的好处。良好的近红外传输，使得它非常有用激光捕获（传输1064纳米等于60％）。超分辨率DIC提供一个专门的棱镜，利用在物镜的数值孔径。

 

荧光显微镜获得了超过30％的强度的的数值孔径100x/1.4客观优势。全内反射荧光显微镜，DIC，和标准的荧光显微镜的技术也可以结合。

 

 

组态

TIRFM作者的设置（表2和表3中给出的细节）使用IX70倒置显微镜（奥林巴斯美国公司），配备包括右侧的的相机端口和IX激光端口。激光位于左侧的显微镜。通过180毫米的的港口激光管透镜的激光投影到出射光瞳的照明/成像透镜（参见图5）。

http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-05-23/1acf43bf972d44ee5a76cd0f0726d46b.jpg

作为光源，20毫瓦的低噪声固态激光器，发射532纳米（激光，内华达州里诺市的Crysta），被使用。氩气，氦气，氖气，氪激光器也可以被使用，无论是直接地或通过光纤耦合。

 

用全反射荧光显微术实现的有限的图像强度，表明冷却的黑白相机，如OLY-110，OLYMPIX 2000或MagnaFire（奥林巴斯显微镜美国公司）的使用。

 

样品安装IX70 TIRFM
（从奥林巴斯美国公司的产品）

类型	描述	数量
IX701F	IX701F：倒置显微镜支架	1
IX-PR100R	右侧的相机端口适配器	1
5-UR480	I7-DIP/RFAC：激光端口B	1
5-UR481	激光管透镜端口B	1
2-U1002	WH10x：目镜	1
2-U100H2上	WH10xH-2：目镜	1
5-UL210	IX-ILL 100LB：照明支柱	1
8-C406	卤素灯12 V/100 W	1
6-U210	IX-LWUCD：长工作距离（WD）聚光镜	1
U-P230	IX-LWPO：偏振片	1
U-CD436	IX-DPO100：DIC棱镜APO100X/NA1.65	1
U-P100	U-辞典：DIC棱镜	1
U-P235	IX-AN：分析仪	1
5-UE400	IX-RFA / S：荧光照明	1
9-U723	32ND25：25％透射滤光器为佛罗里达州	1
5-UL593	IX-UCLHG：佛罗里达州的集光透镜	1
5-UL500	U-ULH：灯箱佛罗里达州	1
5-UL515	U-ULS100HG：灯座佛罗里达州	1
5-LB256	BH2-RFL-T3：汞灯电源	1
8-B192	HBO103：100瓦汞灯	1
3-U145	U-B190CT：双目对中观察筒	1
4-U220	IX-SVL：左侧把手载物台	1
U-V411	U-CMT：C型安装转接器	1
U-V420	IX-TVAD：适配器	1
1-UB823	UPLAPO10x/NA 0.4，WD 3.1毫米	1
1-UB935	PLAPO100x/NA 1.4，WD 0.1毫米	1
1-UB615	APO100x/NA 1.65，WD 0.1毫米	1
UYCP-11	电力电缆	1
9-U990	玻璃盖5件套APO100x/NA 1.65	1

表2

推荐的第三方硬件/材料

类型	描述	数量
168MX1780	浸入式液体：n（d）= 1.78，0.25盎司 （Cargille实验室） （McCrone Associates）	1
GCL-025-L	激光532-nm 25-mW （激光的Crysta）	1
07BSF013	阻尼稳定杆两个镜像 （Melles Criot），	1
H61386	变焦扩束10-20X （Edmund Scientific）	1

表3

成像实验

玻璃盖，由0.2μm的荧光珠和四甲基若丹明异硫氰酸酯（TRITC）彩色面颊细胞的标本制备的荧光图像和全内反射荧光显微镜图像进行比较（参见图6和7）。

http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-05-23/f2db477c153cdc0356222e06943e8cae.jpg

奥林巴斯显微镜在荧光模式下，集中在有孔玻璃珠，珠荧光是很难区分，因为从脸颊细胞的背景荧光遮蔽。在全内反射荧光显微镜成像模式下，图像的对比度显着高的，有孔玻璃珠可以很容易地观察到。

http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-05-23/a0a4b68d6bd48f5ceb76b30dbd56ba77.jpg

只有在近场（下面试样侧盖玻片表面几百纳米）被激发。面颊细胞的倏逝波的到达，不利于荧光图像。在其他实验中，观察DiI染色的Hela细胞和神经元，荧光和全内反射荧光显微镜进行了比较。在每一种情况下，全内反射荧光显微镜允许非常高的对比度观察细胞表面（图8和9）。

http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-05-23/09c540faa97e588f1c85023d702f416b.jpg

 

结论

APO 100x/1.65是一个非常高的分辨率物镜是提供TIRFM利息增加的时候。的物镜，方便的IX70配置，相对经济的固态激光器的高数值孔径带来TIRFM技术显微成像技术成为主流。的客观与TIRFM中的应用提供新的和令人兴奋的调查研究界的机会。