乘法荧光标记标本在检查过程中，数字记录，两个或两个以上的发射信号往往可以重叠在最终图像中，由于其靠近内的微观结构。这种效应被称为共存，通常发生在荧光标记分子结合到目标在于非常接近或相同的空间位置。具有高度特异性的现代化合成荧光和古典免疫技术的应用已显着提高，加上精密光学部分和数字图像处理共聚焦和多光子显微镜所提供的马力，能够检测生物样品中的共存。

共定位，在生物表现，由驻留在同一物理位置的一个标本的两个或两个以上不同的分子的存在下定义。组织切片，单个细胞或亚细胞细胞器的显微镜观察的范围内，共定位可能表明这些分子是相同的受体，而在数字成像的上下文中，该术语是指通过荧光发射的颜色共享相同的图像中的像素的分子。在激光共聚焦显微镜，标本记录的数字图像，多维数组，包含许多量元素称为体素表示三维像素组成。的目的，光照波长共焦检测器针孔直径的数值孔径，是由一个像素的大小（或检测体积）。因此，共存的两个荧光探针的Alexa Fluor 488的一个标本，如具有绿色发光和Cy3橙红色的发射，表示图像中的像素包含红色和绿色的贡献（通常是生产各种深浅不同的橙色和黄色）。

作为一个例子，在图1中示出的图像序列的共定位在细胞骨架蛋白，肌动蛋白，纽蛋白的蛋白质与粘着，粘附路口的横向光学平面（ - Ý轴用激光扫描共聚焦显微镜）。这些复合物作为成核点肌动蛋白丝和外部介质，质膜和肌动蛋白细胞骨架之间的交联剂。图1（a）是扫描收集过滤的Alexa Fluor 568（纽蛋白）的发射光谱的检测器，信道，用543纳米的氦氖激光激发时，而图1（b）是信道过滤，收集荧光在488纳米激发的氩离子激光的Alexa Fluor 488（丝状肌动蛋白）的排放量。数字组合的两个图像（图1（c））揭示了丝状肌动蛋白纤维的末端的两个荧光信号的共定位。

重要的是要注意，共定位并不是指相似的发射光谱的荧光基团的可能性将出现在合成图像中设置相同的像素。准确的共存分析的荧光发射光谱是唯一可能的，如果充分分离荧光团之间的和正确的过滤器集（或光谱狭缝宽度）的使用在收购序列。，如果光谱泄放通过工件的高度之间的荧光团的发射光谱，或由于使用不正确的过滤器组合的光谱重叠的，因为本，共​​定位测量将是没有意义的。为了避免工件，必须仔细匹配的荧光照明源（在共聚焦显微镜的激光线），同时仍保持一个有用的发射波长之间的分离程度，以获得最大的激励效率的功率谱。在大多数情况下，明智地选择荧光基团进行共定位分析获得令人满意的结果是最重要的。

在图2中，提出了一系列的Alexa Fluor染料组合是潜在有用的共定位实验光谱重叠比较。所有的发射光谱进行归一进行比较，而且，由灰色阴影表示的重叠区域。在图2（a）中，绿色荧光体的Alexa Fluor 488和橙黄色荧光的Alexa Fluor 555染料的发射光谱为表示明确分离的峰值波长，这也很容易被人眼区分。然而，中等水平的光谱重叠（灰色阴影区域）示出存在着相当大的Alexa Fluor 555（以黑线，从发光峰值到横轴表示发光波长峰值的Alexa Fluor 488的排放量） 。这种高层次的信号流血通过呈现分离的探头的情况下，很难的Alexa Fluor 488荧光信号强度明显大于的Alexa Fluor 555，这可能是由于一些因素，包括差异较大的荧光目标人群。其结果是，应避免这些探针的组合的共定位实验，或只用图像采集时，在multitracking共焦模式下，以减少或消除渗出。

Alexa Fluor探针的光谱之间的重叠发射最大值之间的带宽增加而减小，如在图2（b）所示。在这种情况下的Alexa Fluor 488和深红色荧光的Alexa Fluor 633的图图2（a）相比表现出显着降低的水平时的重叠。应产生良好的效果，以最小的流血通过在共定位实验中，两种染料对人的眼睛和光谱重叠的程度低，很容易分辨的，所提供的每个探针的浓度类似的（注意，深红色的Alexa Fluor 633的荧光可能是很难想象，通过在低浓度时，在显微镜目镜）。最有效的Alexa Fluor 633由633纳米线的一个红色氦 - 氖激光激发，但也可用于与594纳米线的一个黄色的氦氖激光。也许是最好的发射可见光的Alexa Fluor染料的光谱分离的Alexa Fluor 488的Alexa Fluor 647（图中未示出）的组合。几乎没有这些染料和流血，通过文物的光谱之间的重叠，应该是不存在的，即使是在标本中含有过量的Alexa Fluor 488。具有这些特征的荧光探针共存调查，配备适当的激光共聚焦显微镜的理想人选。

是有限的能力确定的共定位在共聚焦显微镜的光学系统的分辨率和用来照亮标本的光的波长。宽视场荧光和共焦显微镜的理论分辨率为约200纳米（0.2微米），但在实践中，这个数目下降到400和600纳米之间的值的原因有多种，包括未对准的显微镜，折射率波动，光学畸变，试样制备不当。然而，在几乎所有的情况下，一个完全调谐的激光共聚焦显微镜的光学分辨率极限是不足够的，以确定两个荧光分子是否被附加到一个单一的目标，或者他们是否驻留在相同的细胞器。许多实验方案的设计高度特异性的合成探针或抗体针对本地化和明确的蜂窝结构，很容易受到歧视的周围。其他产生标本与探头之间的重叠程度高的区域显示。

对于小于5微米的厚度，如粘附细胞或非常薄的组织切片的标本，共定位定量分析往往是可能在传统的宽视场荧光显微镜。然而，对于更厚的试样，图象应记录，可作为有限的轴向尺寸，以确定是否表面上共定位的荧光团的实际驻留在相同的横向焦平面或者他们是否在彼此沿显微镜的z轴垂直叠加的光学部分。应该由获得薄的光学部分，可以使用激光扫描或旋转盘共聚焦和多光子显微镜厚标本的荧光基团的共定位分析。多光子工具往往能激发一个单一的近红外激光光谱线的焦点目标高度定义的音量都荧光双标记标本。这种独特的功能限制只居住在焦平面，这大大降低了漂白文物和背景噪音的荧光基团的荧光发射。

软件共定位分析

标本中的荧光基团的共定位的程度的测量是通过比较等效所获取的图像的各像素位置中的颜色值。在分析过程中的第一个步骤涉及的图像显示在其上的共定位测量将被执行，无论是作为一个复合材料是来自于两个独立的信道单波长收购（优选的技术）或乘法标记的试样作为一个单一的图像获取。检查样品，具有两个以上的标签时，只有两个假色是在一个单一的计算处理，但是所有的伪彩色排列随后可以被选择作为对共定位分析。通常情况下，红 - 绿色对被选择用于共焦荧光由于传统使用的氩离子，氪，氩，氦 - 氖激光器，它能够有效地刺激强烈的蓝色和绿色区域的荧光团的吸收光谱线。此外，人眼更敏感的色调中的绿色和红色的

奥林巴斯显微镜

共定位分析的试样pseudocolored图像的图形显示，方便地表示一个散点图（有时也简称为fluorogram）的，该关联两个数据集之间的关系或关联。的散点图图形的一个伪彩色（或通道）的强度与另一种在图像中的每个像素，或选择的感兴趣区域，一个两维的直方图（见图3和图4）。一个信道（通常为绿色）是沿图表的x轴，而其他的（通常为红色）Ý轴强度的取值范围从0到255的横坐标和纵坐标上绘制。因此，合成图像的每一个像素，其特征在于由一对笛卡尔坐标系中的坐标出类拔萃的强度。的分布模式的分析所产生的强度对可识别的荧光基团的共定位，以及背景歧视，渗色，漂白，和缺乏各信道之间的登记。

图3示出了3个双通道共聚焦显微镜的光学部分的图像平面（pseudocolored红色和绿色），从试样具有不同程度的荧光基团的共定位，以及与它们对应的散点图。位于附近的散点图的原点（0,0）的像素在每个通道具有非常低的强度，而较亮的像素的距离越远，在整个图形中分散。在散点图相关的红色和绿色通道，纯红色和绿色像素往往集中轴附近的情节，而共定位像素，如果存在的话，会出现彩色的橙色和黄色的色调（取决于共存的程度），跌近中心（X = Y）和上右上角的散点图。

在图3中的标本，包括大鼠脑海马冠状厚款标示的Alexa Fluor 488（神经纤维）和Alexa Fluor公司568（胶质纤维酸性蛋白GFAP，图3（a））。在图3（b）所示，而兔肾上皮细胞（RK-13 ​​行）共同表达一个印度麂鹿皮肤成纤维细胞染色的Alexa Fluor 568针对纽的Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽（丝状肌动蛋白）荧光蛋白，红色荧光蛋白和EYFP，本地化到细胞核，图3（c）中所示。相关的散点图的正下方的检体的图像（例如，图3（d）是图3（a）的散点图），两个通道共定位的程度是由白色字母和数字表示在左下右下角的每散点图。请注意在图3（a）的共定位（只有一对夫妇％的两个通道）相对缺乏，逐步提高的程度的共定位在图3（b）和图3（c）中，设有约30％和85％的系数元。

由图4中显示的图像，这是使用印度麂成纤维细胞染色的Alexa Fluor 568（纽红色通道）和Alexa生成的序列散点图分析荧光共定位，利用共聚焦显微镜和售后成像程序制造商提供的典型的软件概述氟488（丝状肌动蛋白，绿色通道）。一个地区的利益分析散点图中，选择白色矩形图4（a）表示。此区域设置的阈值电平的信号，将包含在大多数共定位的软件程序所执行的分析。

概述感兴趣的区域的垂直和水平边缘应对准，以排除背景信号，这是聚沿x 和Ý轴的散点图。只有包括在所选择的区域的边界的像素所产生的信号进行分析，在估计的共定位。重叠在该样本中的像素区域，容易地转换成共定位二进制阈值掩膜（图4（b）），它可以被叠加在图像上（图图4（c））作为共定位地图的。在图4中的地图上示出的阈值部分（c）表示在白的共定位区域，但这种颜色可以很容易地与大多数软件应用程序改变为另一种颜色，产生更高程度的对比，相对于原来的假色。

正如上面所讨论的荧光共定位，定量评估，可以得到共焦光学部分使用散点图和选定地区的利益获得的信息。几个值的生成使用从整个散点图的信息，而另一些则是来自于一个选定的感兴趣区域内包含的像素值。其中的变量来分析整个散点图的Pearson相关系数（ŗ（R） ），是其中一个应用在模式识别匹配的一个图像到另一个为了描述两种模式之间的重叠度的标准技术。Pearson相关系数的计算方法，根据公式：

其中，S1是在第一通道中的像素的信号强度，S2是在所述第二通道中的像素的信号强度。数值S1和S2 （平均）（平均）是第一和第二通道中的像素的平均值分别。Pearson相关性，从 ​​原来的亮度值的平均像素强度值中减去。作为一个结果，这个系数的取值范围从-1到1的值，值为-1表示完全缺乏对从图像中的像素之间的重叠，和一个值为1表示完美的图像配准。Pearson相关系数占仅用于两个图像之间的相似性的形状，不依赖于图像的像素强度值。然而，当应用此系数的共定位分析，潜在的负面值很难解释，需要另一种方法来阐明分析结果。

往往一个简单的技术来计算出一个替代的相关系数涉及到消除减法平均像素强度值从原来的强度。正式定义的重叠系数（R），这个值的范围在0和1之间的图像分析的强度变化是不敏感的。重叠系数被定义为：

分子的商品通道的强度，并返回一个显着的值，只有当这两个值属于参与共定位的像素（如果两个强度都大于零）。其结果是，方程（2）中的分子共定位的像素的数目成比例。以类似的方式，重叠方程的分母是从两种成分在图像中的像素的数目成比例，而不管是否共定位存在（注：红色和绿色的图片或从通道的像素阵列的组件被定义为1和通道2，分别）。重叠系数的一个主要优点是其信号强度的差异的图像，这往往是产生的荧光色素的浓度波动，光漂白，量子效率的变化，和非同等作用的电子通道设置的各个组成部分之间的相对不敏感性。

使用重叠系数的最重要的缺点是在每个通道中的图像特征的数量之间的比率的强烈影响。为了缓解这一依赖性，重叠系数被划分为两个不同的子系数，称为k（下1）和K（2）作为两个独立的参数，以表达程度的共定位

的重叠系数K（1）和K（2） ，描述在通道之间的强度的差异，与敏感通道2的强度的差异（绿色信号）K（1） ，而k（下2）取决于直线上从信道1（红色信号）的像素的强度。到目前为止所描述的方程能够生成的信息的重叠度，可以占到颜色通道之间的强度变化。为了估计贡献一个颜色通道中的共定位的图像区域的整体的共定位荧光量，一组额外的共定位系数，米（1）和米（2） ，定义为：

的的共区域化系数米（1）来描述从通道1的共定位区域的贡献，，而系数米（2）是用来描述从通道2相同的贡献。请注意，变量S1（COLOC）等于S1（一）如果S2（一）是大于零为变量S2（COLOC）的，反之亦然。这些系数的共定位在每个通道中的合成图像，相对于在该信道的总荧光的荧光团的荧光的量是成比例的。共存系数米（1）和米（2）即使当在两个图像通道的信号强度有显着不同的水平，可确定。

可以计算出第二对共存系数散点图上划定的利息由区域定义为像素强度范围。系数M（1）是用于描述信道1的荧光基团的共定位区域的贡献，而M（2）是用来描述通道2的荧光基团的贡献。这些共存系数被定义为：

其中S1（COLOC）等于S1（一），如果S2（一）位于感兴趣的地方的阈值范围内的区域（左和右两侧的矩形ROI）和S2（一）表示的像素值超过阈值水平，则为零。同样，S2（COLOC）等于S2（一）如果S1（一）位于感兴趣的地方的阈值的区域（顶面和底面的矩形ROI）内，如果S1（一）是感兴趣的区域之外，则为零。换句话说，对每个通道，分子表示在该信道，也有来自其它通道的一个组成部分的所有像素强度的总和，而分母表示从信道的所有强度的总和。这些系数是在每个通道中的合成图像，相对于在该信道的总荧光共定位对象的荧光的量成比例。

大部分的共定位软件分析程序提供商业上是能够计算的参数描述的上面，包括Pearson相关系数，总的重叠系数，以及在个别Ķ（x）的，M（X） ，和中号（x）的共定位系数。此外，许多程序都包含算法申请背景减法更正，整个图像生成散点图，并/或使用选定的感兴趣区域单一双通道合成图像或沿轴向平面光学栈进行计算。从这些软件产品的最重要的数据输出的的共区域化系数，这表明信号之间的相对程度的重叠。例如，一个共定位系数值为0.75的荧光团在通道1中表示所有的通道1，通道2的组件的强度，通道1的所有强度的总和除以该比例是75％。这是一个比较高的程度共存。同样地，为通道2的荧光基团值为0.25表示的共定位（等于三分之一的信道1的荧光基团）的显着的水平降低。

文物和标本共定位分析中的注意事项

其中最重要的共定位分析中遇到的工件的渗色光谱发射光谱重叠，自体荧光（主要组织标本），和非特异性抗体或合成的荧光染色。荧光共振能量转移（FRET）的共定位荧光光谱剖面紧密重叠也是一个潜在的神器。这些文物能够生产出现黄色或橙色的图像像素，但不会出现共存时，标有绿色和红色荧光探针的研究标本。

也许是最常见的问题是渗色的荧光强度时，具有两个或更多的荧光标记的成像标本。例如，双标与传统的绿色和红色探针，荧光素和罗丹明时，扩散到只能降低通过使用优化的荧光过滤器集，但不会完全消除。这种效果是由于这样的事实，这些染料具有很宽的吸收光谱和发射光​​谱，表现出显着程度的​​重叠。因此，使用488纳米的氩离子激光谱线的荧光素的激发也将产生激发罗丹明，尽管在较小的程度。此外，荧光发射将被检测的光电倍增管通道或广角过滤器集保留供的罗丹明，生产出现黄色或橙色，即使在共存​​的情况下，是不存在的像素。为了进行这些和类似荧光共定位实验，扩散到工件必须完全消除。

与渗色的问题，在传统的荧光团（如荧光素和若丹明），通常可以通过使用新的生物改进和更明亮的Alexa Fluor家庭或硫杂羰花青染料（循环系列）合成探针，如克服。许多这些特别设计的有机分子具有很窄的发射光谱（比传统探头），大消光系数，正好与电弧放电灯和激光谱线，提高量子产率，降低漂白，少依赖的荧光发射环境变量。此外，这些先进的探针可跨越的带宽大约为400纳米的激发光谱公司，从紫外到近红外，确保各种各样的选择，以配合以最小的发射光谱重叠的照明光源。

自体荧光，这是更为显着甲醛固定的组织标本，文物在外观上相似，通过流血。常常导致其他渠道产生图像出现有共定位荧光发射检测的标本展出的自发荧光的激发。过高的背景染色抗体和合成的荧光基团，也可以像在两个荧光基团的地区，都表现出高水平的非特异性染色的共定位。此神器通常可以被避免或至少，显着减少认真准备标本，适当控制和监测协议。

共存调查只能算是准确的，当所有的出血，自发荧光，和非特异性荧光文物已被淘汰。最有效的方法是利用共聚焦显微镜扫描配置顺序激发发射信号，并收集与排放窄带通滤波器（或光谱仪的狭缝宽度）。同时，单标记控制标本应进行检查，以确保彻底消除流血通过，未染色的控制可以有效监测自发荧光。流血通过校正软件可用于许多共聚焦显微镜图像被抓获时，使校正。

放气通过文物和校正激光扫描共聚焦显微镜的各种标本图5所示。图5中的成纤维细胞（一）描绘扩散到MitoTracker红（红色荧光），以用于产生黄色的肌动蛋白丝，当试样被扫描的同时用氩离子（488进入通道的Alexa Fluor 488（绿色荧光）纳米谱线）和绿色氦氖激光器（543纳米线）。顺序的扫描和检测（图5的（d））消除了渗色。同样，发生流血通过在小鼠肠粗节（图5（b）），同时扫描Cy3和核探针，DRAQ5，加上绿色和红色氦氖（633纳米线）激发。顺序扫描标本（图5（E）），消除流血通过伪装成共存的神器。

乘法标记的试样的情况下，有两个以上的激光扫描，扩散到工件在多个通道中经常观察到的Alexa Fluor 488标记的大鼠脑组织厚的边的图5（c）和第5（f）所示（神经纤维）的Alexa Fluor 568（GFAP），DRAQ5（核）。渗色出现在第二和第三通道，当试样具有三个激光器（图5（c）），同时扫描，说明在此试样的中间纤维之间的共定位的潜力。然而，启动顺序扫描和数据收集时，长丝只出现在其各自的通道（图5（f））的考虑，消除了在这些结构中的荧光基团的共定位。

荧光共振能量转移，这在理论上可以测量两个位置密切的荧光团之间的短距离，也是一种潜在的有用的工具，用于监测共存。然而，这种现象往往会导致的文物，在共存分析，除非必要的FRET具体参数都很好理解，并充分考虑在设计的实验。具体而言，调查员应该是有关使用具有相同的带宽占用的频谱公司的探针时，特别是在区域中的第一荧光团的发射光谱与激发光谱的第二个重叠。在这些试样中的能量转移是表现在一个意想不到的减少从第一荧光发射的荧光团沿第二探针具有相似的发光强度的意外增加。密切相关的荧光团之间的相互作用还可以导致淬火所发出的荧光信号，这取决于环境条件。

可以规避许多潜在的器物共存分析样品制备技术通过注意。如上所述，荧光探针的选择应广泛分离以最小的重叠发射光谱的档案。如果可能的话，选择一个具有窄的发光试样（如Alexa的荧光染料或量子点）和一个红色的深的红色或近红外区域中的荧光基团发出的绿色荧光。必须进行测试，初级和次级抗体的交叉反应性和非特异性背景染色。加载合成荧光标记的二次抗体浓度应进行优化，以确保类似的亮度水平，尤其是当目标丰截然不同。荧光团亮度的影响因素是激励效率，量子产率，消光系数，浓度，以及环境因素，如pH值，离子浓度，疏水性，和粘度。对照样品也应另外每个荧光染色渗出通过分析和自体荧光的特性，分别在没有准备。仔细注意小的细节在染色协议将缓解恢复数字图像通过收购后处理算法的必要性。

实用方面的共定位分析

有关审核和分析复杂的荧光图案的组合的伪彩色显示，使用是非常有用的，因为上面已经描述了。一般，两种颜色的通道都被选中，最常见的是绿色和红色的，因此，重叠区域出现黄色。其他颜色的配对，如蓝色和绿色的（高产青色）以及蓝色和红色的（产品红色），也可以采用，但是不太有效的目视检查，因为人眼敏感度的降低反映了蓝色的波长。然而，在许多情况下，特别是与三色图像，使用蓝色的信道伪彩色是不可避免的。

在规划的图像采集和显示参数，应采用标准的组合图像具有相同的动态范围和偏移每个荧光信号。事实上，标准的共聚焦显微镜实践表明这种方法对所有常规标本分析。一旦合并，重叠的红色和绿色信号会产生一个明确的明亮的黄色信号，如果有足够多的光子收集。在光子饥饿实验，暗黄色的色调所产生的共定位荧光和平等贡献的绿色和红色的背景会出现褐色。

应单独调整每个通道的偏移和增益控制（设置背景到零，饱和度为255），使各荧光显示的使用完整的8位（256级灰度）的范围。单独的图像可以被处理和合并。虽然这是一个方便的方法来获取和显示多色图像，这两个信号的相对幅度在试样不能确定，因为每个信号被收购，以填充整个图像的位深度。因此，在一个给定的颜色通道的相对信号强度的分析将需要关于以类似的方式被配置在光电倍增管电压，增益和偏移量的信道。

如果采集和处理技术不均衡，可能会导致不准确的解释，关于合并的彩色图像中的共存不当增益和偏移配置的光电倍增管在收购过程中，由于在图像处理过程中的极端直方图拉伸。例如，如果黑电平（偏移量）的值过高，可能会出现不同的颜色分割，较低的黑电平设定和对比度降低的条件下观察到的相同的结构。对于重要的应用，比成像技术可以应用来区分信号的共定位，并仅部分重叠的信号。

一个完全一致的荧光成像系统的图像点源在试样精确登记，像素对像素，在探测器时，使用不同的过滤器集。然而，文物等的客观色彩校正不足或不佳对准过滤器可能会导致损失登记之间的合并，往往位移均匀颜色辨认颜色的荧光信号。对于复杂的图案和明亮和暗淡的信号混合的图像，这种效果可以去未被发现，导致信号分布结构是不同的或部分重叠的结论。

在图像处理过程（操作称为平移）合并后的图像恢复注册使用许多可用的软件包，可以缓解位移文物。通过平移对齐一组着色层的能力需要重合的参考点，在每一层中存在的试样中的存在。如果一个乘法染色的参考点不存在，多色荧光胶乳微球可以加入到试样中得到每个视场的一些有孔玻璃珠之前安装有玻璃盖在一个较高的稀释。对于重要的应用中，一个单一的具有多个带通二色镜和屏障过滤器的过滤器设置可以具有不同的激光或特定荧光染料的激发的荧光信号的所有过滤器一起使用。使用这种配置在激光共聚焦显微镜，适用于广角荧光色彩校正是至关重要的。

图6中所示的几种常见的工件上面所讨论的，这往往妨碍准确的共定位分析多个荧光团（请注意，在图6中的所有荧光基团的组合，只发出绿色和红色荧光）标记的标本。甲人类女性骨肉瘤上皮细胞（U2OS线）转染增强的黄色荧光蛋白融合到过氧化物酶体定位的肽序列（绿色荧光），随后免疫荧光标记的第二抗体共轭的Alexa Fluor 568（红色荧光）针对过氧化物酶体膜蛋白（PMP -70）的是，在图6（a）和图6（d）。在图6（a）中的黑电平设定为图像过高，导致降低强度为黄色荧光蛋白标签。这个错误扭曲共存分析，产生人为的低检测水平从绿色通道的重叠像素。的适当均衡化后的图像示于图6（d），这表明一个显着较高程度的共定位。

在恒河猴肾上皮细胞（LLC-MK2线）是线粒体的网络增强黄色（EYFP）和HcRed1荧光蛋白载体肽序列靶向线粒体共转染。在成像过程中，显着的亮得多的EYFP黯然失色的荧光信号从HcRed1，弱几乎是100倍时，探测器通道具有类似的电压，增益和偏移设置（图6（b）条）。调整在HcRed1检测器的信道值，以平衡的荧光蛋白质的发光强度，克服了这种差异，揭示了一个显着量的共定位（图第6（e））。请注意在调整后的图像相比，主导与紧密匹配的信道捕获的图像的绿色色调的荧光黄色的外观。

重叠的信道误登记为塔尔羊的卵巢细胞（HJ1.Ov线）染色的Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽（绿色丝状肌动蛋白）的Alexa Fluor 568的二级抗体靶向鼠抗纽（在图6（c）所示焦点粘连）。肌动蛋白丝的两端应与纽在这个标本共定位，但他们稍微出在图6（c）登记，为的是在较低的图像右上角有红色和绿色荧光标记的微球体。收购后的图像处理对齐的通道（图6（f）条）还原图像配准的（微球），以产生一个很好的候选人的共定位分析。

结论

其中最重要的点进行调查荧光共定位时要考虑的是标本标签，以确保尽可能高的质量。应分析抗体和合成的荧光基团，和选择特异性，背景低，并缺乏交叉反应性。为了减少出血，通过文物，广泛分离发射光谱的荧光探针组合最适合共存实验。流血通过实际的实验条件下，适当的控制，包括标有每个探头单独作为以及作为未染色的自发荧光标准的标本，应编制和审议。一旦检体参数进行了优化，仪器和软件的考虑可以得到解决。重要的是要记得那个可怜的样品制备通常不能克服的数字图像处理技术。在大多数情况下，标记条件的完善，将节省了大量的时间，并最终取得优异的业绩。

仪器配置要求，最高质量的复消色差显微镜物镜是必要的，以减少色差，定量的共定位计算，将产生负面影响。许多厂家纷纷推出计划复消色差透镜校正色差超过整个可见光波长区域（400-700纳米），这显着有利于定量荧光显微镜调查目标。所有的荧光发射过滤器应进行优化匹配的荧光光谱与带通传输特性。这是用于控制泄放通过从其他试样中的荧光基团的其中一个最重要的考虑。如果渗色，在对照组（单探头和自发荧光）检测，顺序扫描试样采用显微镜配备一个声光可调谐滤波器（AOTF）为multitracking将产生最佳的结果。在某些情况下，可能是流血通过软件修正之前，必须继续共存分析。