路遥说，人生的道路虽然漫长，但紧要处常常只有几步，特别是当人年轻的时候。同样的，科研的道路虽然漫长，但决定成就的只有几点，特别是做实验时是否谨慎。

影响Sanger测序结果的条件有很多，前面已经详细介绍过了单条带稳定的PCR产物的制备，今天为您解析另一个关键因素——如何选择测序引物。

测序引物不能等同于PCR扩增引物，需要满足以下几个条件：

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比较 |通用引物优势显 

测序通用引物一般是根据载体的元件（启动子、终止子等）选择的，例如常见的通用引物T7即T7启动子，CMV-Forward是由CMV启动子设计的，M13F则是根据lac Z基因得来的。现在常说的通用引物还包括针对某些载体设计的载体引物，例如根据载体的绿色荧光蛋白基因设计的载体引物pEGFP-C-3。

测序公司通常会免费提供一些常见通用引物。这些经过QC验证的引物，质量上有更好的保证。用载体的通用引物测序，可以监测出目的片段是否成功克隆到载体中（是否为空载）。考虑到通用引物的技术和成本优势，金唯智建议您实验中尽可能选用通用测序引物。

一般情况下，PCR产物（尤其是较短的PCR产物）测序结果不理想时，可以将PCR产物克隆到载体中，用载体的通用引物测序。特别是当PCR片段长度小于200bp时，建议您优先选择克隆到载体中测序。

配对|载体、位点是关键    

通用引物只与载体相关，不受目的片段限制。测序时，不同载体需选择不同的通用引物。

某个载体该选用什么通用引物，可以通过金唯智公司官网上“服务资源”中的“金唯智免费通用引物”或者登录金唯智在线订单系统中的“通用引物选择工具”进行查询。

几种常见载体所使用的通用引物

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​除了载体，引物结合位点对通用引物的选择也有很大影响。由于Sanger测序法的局限性，通常刚开始的50bp-100bp测序不太稳定，通用引物不能距离克隆位点太近（建议大于50bp），否则有可能会导致部分目的片段测不出来。因此，T载体（pMD 18-T载体）的测序通常选择正向引物M13F（-47）和反向引物M13R（-48）而不建议选择M13F和M13R。 

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图示：M13F和M13R虽然在T载体克隆位点两端也有结合位点，但是距离多克隆位点太近（约30bp），因此对T载体测序通常会选择距离克隆位点约50bp的正向引物M13F（-47）和距离克隆位点约60bp的反向引物M13R（-48）。

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