实验结果采用均值±标准差（±s）表示，用SPSS11.5软件包进行统计分析，采用方差分析及q检验进行统计学处理，以P<0.05表示差异的显著性。

【关键词】  吡格列酮；脂多糖；神经元；NO

    Griess 法测定培养液中NO 的含量［5］ 。Griess法原理是根据NO2+ 与Griess试剂反应生成红色化合物，颜色深浅与体系中的NO3+ / NO2+ 含量成正比，从而测定NO含量，是一种间接检测NO 的方法。以1 mol?L -1亚硝酸钠溶液,配制终浓度分别为0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol?L-1的亚硝酸钠液。按50 μL/孔，在96孔板中加入标准品和样品。按50 μL/孔，各孔中分别加入室温Griess Reagent I 和Griess Reagent II。于540 nm 处测吸光度值(OD540)。以亚硝酸钠浓度(μmol?L-1) 为横坐标,所测OD值为纵坐标,作出标准曲线,并求出回归方程及相关系数。

    1.3  药物处理

    近年来的研究已显示脑内炎症反应参与了阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)以及帕金森病(Parkinson isease ,PD)等神经元变性疾病的发病过程［1］。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是一种以氨基苷为组成单位的磷脂，构成革兰阴性菌细胞壁成分，是一种强效的炎症反应诱导剂。Heneka等研究表明布洛芬和吡格列酮可以通过激活过氧化物酶增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)γ受体减轻神经胶质细胞的炎症反应［2］。Xing B等研究指出，吡格列酮对抗脂多糖诱导的多巴胺能神经元损伤通过抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达和NO的产生［3］。NO是体内广泛存在的一种细胞信使分子，具有生理性代偿和病理性神经毒双重作用。本实验通过体外培养乳鼠皮层神经元细胞，经LPS刺激造成神经元损伤模型，观察吡格列酮是否能抑制LPS引起的神经元NO释放增加，同时探讨吡格列酮抑制NO释放的可能的信号转导机制。

    1.5  统计学处理

    吡格列酮由Takeda 公司提供 (批号：060901，纯度>99% )，用二甲基亚砜溶解。二甲基亚砜、脂多糖、DMEM、F12、胰蛋白酶（1∶250）、L-多聚赖氨酸购于SIGMA公司；GW9662(货号：CAY-70785-M001)、SP600125(货号：JBS-INH-006-M002)购于厦门励远有限公司；一氧化氮检测试剂盒（货号：S0021）购于碧云天生物技术研究所；胎牛血清、HEPES、马血清购于北京华美转导科技有限公司；临用前用DMEM稀释到所需浓度，其余试剂均为分析纯。

    1.2  大脑皮层神经元细胞原代培养

    1.1  药品和试剂

    Abstract：Objective  To explore the express effects of pioglitazon (Pio) on lipopolysaccharide-induced NO production to cultured cortical neurons and investigate its signaling pathway. Methods  The inflammatory neurotoxicity model was constructed in primary cortical neurons isolated from Sprague-Dawley rats 6～7 d neonate rats following a dose lipopolysaccharide to the neurons directly. The contents of NO was detected. Results  The cells, exposed to LPS(10 μg/mL for 8 h),showed charateristic change of damage, which could be relieved by pioglitazon(1 μmol/L) with cell survival rate increment. Pioglitazone could block the increase of NO induced by LPS. Conclusions  Pioglitazone can prevent the neurons from the damage of LPS inflammatory neurotoxicity.

    Key words:pioglitazon; lipopolysaccharide; neurons; NO

    参照文献［4］ , 取出生24 h内的SD 大鼠乳鼠, 75%酒精浸泡消毒，无菌条件下取出大脑皮层，置于培养基中，剔除血管和软脑膜，用培养基清洗1～2 次。将脑组织移入另一含培养基的容器中,护士职称论文发表，然后剪成1 mm3 大小的组织块,康复职称论文。加入 0.125%胰蛋白酶溶液37℃消化10 min, 并不时轻轻吹打。待大部分细胞分散后，即加入完全培养基终止消化。200 目筛网过滤,1 000转离心10 min, 用含10%胎牛血清、10%马血清的完全培养基将细胞制成悬液, 调整细胞密度,医学副高论文, 以5×105 /mL接种在多聚赖氨酸处理过的培养板中,副高职称论文, 置于37 ℃、5%CO2 培养箱中培养。48 h后加入含阿糖胞苷(终浓度为5 mg/L)的维持培养基, 抑制非神经细胞增殖。以后每3天换液1次,护理职称论文代发,培养7 d后用于实验。

【摘要】  目的 探讨吡格列酮(pioglitazon, Pio)能抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 引起的培养大脑皮层神经元一氧化氮释放增加，并探讨其抑制作用信号转导机制。方法 以体外培养6～7 d的乳鼠大脑皮层神经元为研究对象,建立脂多糖损伤和吡格列酮保护模型。采用Griess法测定细胞培养上清液中NO含量。结果 脂多糖可导致神经细胞损伤，培养液中NO 含量升高；吡格列酮（1 μmol/L）可明显抑制脂多糖引起的NO含量的升高。结论 吡格列酮可明显拮抗脂多糖诱导的神经细胞损伤。

    神经元细胞培养7 d后，首先用终浓度为10 μg/mL的LPS分别加入培养基中共同培养1、2、4、8、16、24、48 h观察LPS对NO释放的时间变化规律；加吡格列酮组：在培养基中加入终浓度为1 μmol/L吡格列酮作用1 h后加入LPS10 μg/mL共同培养8 h ；阻断剂组：在培养基中加入终浓度为5 μmol/L的JNK通路的特异性阻断剂SP600125共同培养一小时后加入LPS10 μg/mL再共同培养8 h。

    1.4  指标检测

    1  材料与方法

• 做好自我介绍及手术室环境
• 卡肌宁0.3～0.6 mg/kg
• 体温35.3℃
• 将患者按入院顺序参照随机数表次序分为硫酸镁治疗组
• 病人极度不适