三 FOSS全自动凯氏定氮仪测氮

一，凯氏定氮的意义

氮素的测量可以估计植物C、N代谢的协调程度及蛋白质含量。凯氏定氮是经典的蛋白质定量方法。

二，凯氏定氮的原理

测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。含氮量*6.25=蛋白含量。

凯氏定氮原理装置图

有机物中的胺根在强热和CuSO₄，浓H₂SO₄ 作用下，硝化生成（NH₄）₂SO₄

反应式为：

　　2NH^2-+H₂SO₄+2H⁺=(NH₄)₂SO₄ （其中CuSO₄做催化剂）

　　2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH₃ ，收集于H₃BO₃ 溶液中

　　反应式为:

　　(NH₄)₂SO₄+2NaOH=2NH₃+2H₂O+Na₂SO₄

　　2NH₃+4H₃BO₃=(NH₄)₂B₄O₇+5H₂O

　　3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量

　　反应式为：

　　(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3

　　(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

结果计算

　　X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%　

　　X：样品中蛋白质的百分含量，g；

　　V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；

　　V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；

　　N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

　　0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

　　m：样品的质量（体积），g（ml）；

　　F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。

三，仪器与用具

    FOSS全自动凯氏定氮仪；消化炉（及其配套 250cm消化管）；电子天平（精确到0.1mg）

四，方法与步骤

1、样品制备

1）  制备有代表性的样品，称约1克（仪器会自动会以此为分母，计算的出含氮量，所以这里的数据不要精确）（精确至0.1毫克）样品放入250ml消化管中。

2）  添加两片特卡托催化片Cu3.5（太贵啦，建议用效果相当的7克K₂SO₄和0.8克CuSO₄·5H₂O的混合物代替，因这里仅是催化作用，所以此两药品的量不需精确）.

3）  仔细添加12毫升浓硫酸，慢慢地摇动，将样品用酸浸湿（并不是一定要浸湿）。

4）  将涤气装置接在支架中的消化管上，将水抽气泵水龙头打开（作用：抽毒气）。

5）  打开消化炉并设定温度为250℃，消化20分钟左右（并不是一定这样，因为升温交慢所以可直接420℃恒温一个小时）。

6）  20分钟后调小抽气泵水流使酸烟恰好吸入涤气罩头（不要太大，否则太浪费水啦）。

7）  再将消化炉温度升至420℃，继续消化直至全部样品变为透明的蓝绿色澄清液体，根据样品种类，消化时间大约60分钟左右。

8）  消化完毕后，将装有涤气装置的消化管连支架一起从消化器中取出，冷却15—20分钟（实际操作不需要冷却）。

2、试剂配制

1）40%NaOH溶液：称取分析纯400gNaOH置于100ml烧杯中，加入蒸馏水，待NaOH溶解冷却后定容至1000ml（实际上无需定容，因为滴定时NaOH溶液是要过量的，整个过程NaOH溶液只定性不定量）。

2）1%硼酸溶液：将100克硼酸溶于10升蒸馏水配成1%硼酸溶液，添加100毫升溴甲酚绿溶液（100毫克溴甲酚绿溶于100毫升无水乙醇），再添加70毫升甲基红溶液（100毫克溶于100毫升无水乙醇），用稀酸或稀碱将1%硼酸溶液调至葡萄酒色（作用：滴定时的指示剂作用）。

3）0.1M HCl 溶液（这里M即0.1mol/L,读作当量）：吸取分析纯盐酸（比重1.19）8.3ml，注入盛有150—200ml蒸馏水的烧杯中，冷却，然后洗入1000ml容量瓶中定容至刻度。用硼砂或无水碳酸钠标定。盐酸的浓度用标定后的浓度，一般都为0.101M或0.996M（此步中每个步骤都是非常重要的，要求都是非常精确的。包括：分析纯盐酸，定容，标定）

3、蒸馏

1)将冷凝水龙头（冷凝作用，将气体冷凝成液体回流到硼酸中，供滴定）打开。打开2300全自动凯氏定氮仪，待仪器自检完毕，按手动模式键。

2）用上下箭头键选择排空“EMPTY BUBETTE”按回车键，再用上下箭头键选择补液“FILL BUBETTE”按回车键，重复几次，直至滴定器中没有气泡为止（几次重复后仍然不能掉的气泡实际操作中不影响结果。如果影响，只影响气泡排出时的那个消化管的含氮量值）。

3)按安装模式键，输入盐酸浓度并按回车键确认。

4）用上下箭头键选择“ANALYSE PROGRAM”按回车键，输入硼酸加入量30ml，水加入量为80ml，NaOH为50ml。（硼酸，水和NaOH的量是计算出来的，并且要求都要过量，及要大于可能的最大值）

5）按分析模式键，用上下箭头选择“RESULT”,再用左右箭头键选择12中不同的结果，用上下箭头键选择“WEIGHT”，输入样品的重量。

6）将消化管放置到仪器上，拉下消化管外的挡板，蒸馏、滴定即开始，蒸馏大约需要4分钟时间。

7）蒸馏完毕，用消化管夹江消化管取下。

8）用蒸馏水清洗滴定缸，关机。再向滴定缸中加满蒸馏水。

五，实验结果偏离的原因分析及其注意事项

1，  试验中，因为盐酸是用来滴定生成的氨的，所以其标定应该非常准确。且每次定容都要定容，建议预先配制足够的盐酸的量，一起定容标定。

2，  1g样品和催化剂的量都不需要精确，即试验中可以称样品0.814g或1.102都对结果影响不大，催化剂可以事先按比例混合后一起量取（并不是称取）。这样可大大提高实验的效率。