液相色谱仪简介（一）液相色谱发展及分类

 

（一）高效液相色谱的历史发展

1903年，俄国植物学家M．S．Tswett发表了题为“一种新型吸附现象及在生化分析上的应用” 的研究论文，文中第一次提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。1906年，他命名这种方法为色谱法。这种简易的分离技术，奠定了传统色谱法基础。高效液相色谱的发展始于20世纪60年代中后期。

二十世纪60年代末期，科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上开发了世界上第一台高效液相色谱仪，发展起新型分离分析技术。1960年中后期，借鉴气相色谱理论和实践的发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了高效液相色谱。

    1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法正式建立。1975年Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。

 

（二）知名的液相色谱仪生产厂商

1.美国Waters

    James L. Waters，行业先锋和企业家，于1958年创建了Waters公司。做过短期的大学数学教师，海军军官和项目工程师后，他在马萨诸塞州Framingham警察局的地下室中建立了他的科学仪器公司。 

    在开发了几种产品后，Waters公司于1963年开发了胶体渗透色谱分析(GPC)仪——GPC100。之后不久在1967年公司采用了紫外线(UV)探测和液－固填料开发出了自动化液相色谱仪ALC-100。 

    1969年，Jim被介绍给了Dimitri D’Arbeloff, 当时Millipore公司的总裁 Jim 邀请 D’Arbeloff 加入 Waters的董事会。 有了Millipore的帮助, Waters牢牢地在分析工业领域站稳了脚跟．在接下去的五年中公司推出了好几个新产品。 Jim逐渐从日常业务中脱身，直到公司于1980年与Millipore合并，他一直是董事长。  

    十五年来合并后的公司努力想找到各自技术的联合点使合并发挥杠杆效应。1993年， Millipore 想出售 Waters公司。1994 年，Waters被一家投资者集团购买。受到了生产线上销售和利润增长，经济增长复苏和公司研发支出解冻的鼓舞，Waters管理层于1995年购买了公司。 

    1996年Waters收购了总部位于特拉华州纽卡斯尔的TA仪器公司，世界热量分析和流变学仪器的主要供应商，以此进一步增强它在化工界的地位。 

同时，制药行业的投资持续长期增长，这使Waters成为主要的受益者。正是在此期间，公司推出了最成功的仪器产品——Alliance HPLC系统。 

    1997年，Waters公司收购了总部位于英国曼彻斯特的Micromass有限公司，这家公司专业生产质谱仪器（MS），这次收购被证明是公司作出的一项重要决策。Waters和Micromass通力合作，成功地把HPLC和质谱—一项重要的、日益流行的分析技术结合起来。HPLC与质谱的检测灵敏度和专属性相结合，其强大的分析能力是许多实验室必不可少的。特别是那些需要高通量处理能力的实验室更少不了它。 

    2002年下半年，Waters和Micromass完成了一项合并计划，使得两家公司可以更紧密的进行合作。尤为值得一提的是，合并产生了一个统一的配送系统，这个配送系统在Waters公司的旗帜下把销售、服务和技术支持融为一体。这个新公司拥有强大的资源优势，能够对主要依靠LC/MS的实验室日益受到的压力作出反应。 

2003年是Waters公司分析仪器行业创新的第45年，公司在提供广泛的技术种类的同时，仍继续生产四个关键领域的平台产品：仪器，化学品，软件和服务。公司最著名的品牌包括，适用于从分析到制备的Symmetry和Xterra色谱柱，用于固相萃取的Oaiss HLB填料，Alliance HPLC和HPLC/MS系统，Empower和Masslynx软件，ZQ质谱检测器，Quattro和Q-Tof质谱和Connections性能保证程序。

 

美国Agilent公司

(内容过长,详细可参照此链接http://wiki.mbalib.com/wiki/美国安捷伦科技公司）

 

其他还有日本岛津、赛默飞等仪器公司的液相产品。

 

（三）几种常见高效液相色谱

 

3.1根据分离机制不同，高效液相色谱可分

1、液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatograph

2、液-固吸附色谱 liquid- solid adsorption chromatograph

3、离子交换色谱 ion-exchange chromatograph

4、离子对色谱 ion-pair  chromatograph

5、离子色谱 ion  chromatograph

6、排阻色谱 size- exclusion  chromatograph

7、亲和色谱(AC) Affinity chromatograph

 

3.1.1分配色谱法

固定相与流动相均为液体（互不相溶）；

1..基本原理：组分在固定相和流动相上的分配

2.流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；

3.固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；

化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。

    分配色谱法是四种液相色谱法中应用最广泛的一种。它类似于溶剂萃取，溶质分子在两种不相混溶的液相即固定相和流动相之间按照它们的相对溶解度进行分配。一般将分配色谱法分为液液色谱和键合相色谱两类。

    液液色谱的固定相是通过物理吸附的方法将液相固定相涂于载体表面。在液液色谱中，为了尽量减少固定相的流失，选择的流动相应与固定相的极性差别很大。由此人们将固定相为极性，流动相为非极性的液相色谱称为正相液相色谱；相反的称为反相液相色谱。

    键合相色谱的固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体或硅胶表面上。目前，键合固定相一般采用硅胶为基体，利用硅胶表面的硅醇基于有机分子之间成建，即可得到各种性能的固定相。一般来说，键合的有机基团主要有两类：疏水基团、极性基团。疏水基团有不同链长的烷烃（C8和C18）和 苯基等。极性基团有丙胺基、氰乙基、二醇、氨基等。与液液色谱类似，键合相色谱也分为正相键合相色谱和反相键合相色谱。

 

在分配色谱中，对于固定相和流动相的选择，必须综合考虑溶质、固定相和流动相三者之间分子的作用力才能获得好的分离。三者之间的相互作用力可用相对极性来定性地说明。

 

分配色谱主要用于分离分子量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化，但在分离过程中容易使生物大分子变性失活。

 

3.1.2吸附色谱法

1.基本原理：各组分在固定相吸附剂上竞争性吸附与解吸固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；

2.流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。        

3.特点：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；

4.缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾

 

    吸附色谱又称液固色谱，固定相为固体吸附剂。这些固体吸附剂一般是一些多孔的固体颗粒物质，在它的表面上通常存在吸附点。因此吸附色谱是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质，其中硅胶应用最为普遍。

    吸附色谱具有操作简便等优点。一般来说液固色谱最适于分离那些溶解在非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子性的试样。此外，液固色谱还特别适于分离色谱几何异构体。

 

3.1.3 离子交换色谱法

1.基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换树脂（固定相）之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；

        阳离子交换：R—SO3H  +M+  = R—SO3 M  + H + 

        阴离子交换：R—NR4OH  +X-  = R—NR4 X + OH-

2.固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；

3.流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；

4.应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。

 

    离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。一般常用的离子交换剂的基质有三大类：合成树脂、纤维素和硅胶。作为离子交换剂的有阴离子交换剂和阳离子交换剂，它们的功能基团有－SO3H、－COOH、 －NH2，及－N+R3 。流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。

    离子交换色谱特别适于分离离子化合物、有机酸和有机碱等能电离的化合物和能与离子基团相互作用的化合物。它不仅广泛应用于有机物质，而且广泛地应用于生物物质的分离，如氨基酸、核酸蛋白质、维生素等。

3.1.3凝胶色谱法

1.原理：又称排阻色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。

小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。

2.固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；可对相对分子质量在103-105范围内的化合物按质量分离

 

凝胶色谱又称尺寸排斥色谱。与其他液相色谱方法不同，它是基于试样分子的尺寸大小和形状不同来实现分离的。凝胶的空穴大小与被分离的试样的大小相当。太大的分子由于不能进入空穴，被排除在之外，随流动相先流出。小分子则进入空穴，与大分子所走的路径不同，最后流出来。中等分子处于两者之间。常用的填料有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺。流动相可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂。

 

凝胶色谱分辨力高，不会引起变性，可用于分离相对分子量高的（大于2000）的化合物，如有机聚合物、从低分子量中分离天然产物等，但其不适于分离相对分子质量相似的试样。

 

从应用的角度讲，以上四种基本类型的色谱法实际上是相互补充的。对于相对分子质量大于10000的物质的分离主要适合选用凝胶色谱；低相对分子质量的离子化合物的分离较适合选用离子交换色谱；对于极性小的非离子化合物最适用分配色谱；而对于要分离非极性物质、结构异构，以及从脂肪醇中分离脂肪族氢化合物等最好要选用吸附色谱。

 

3.1.4离子对色谱

1.基本原理：离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，控制溶质离子的保留行为使其两相之间进行分配；

2.阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；

3.阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子        

4.反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为5.流动相，试样离子X- 进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。

 

3.1.5离子交换色谱

1.基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换树脂（固定相）之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；

        阳离子交换：R—SO3H  +M+  = R—SO3 M  + H + 

        阴离子交换：R—NR4OH  +X-  = R—NR4 X + OH-

2.固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；

3.流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；

4.应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。3 新型高效液相色谱

3.1.6离子色谱

离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。

阴离子交换：R—OH  + Na+Br-  ＝ R—Br + Na+OH-

为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。

 

阳离子交换：R—H  + Na+OH- ＝ R—Na  + H2O

            R—H  + Na+Br- ＝ R—Na  + H+Br-

使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。

若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。

在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。

后来，Frits等人提出不采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。

以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象,可采用电导检测器，解决了传统离子交换色谱需要高浓度淋洗液洗脱、洗脱时间很长以及洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法等缺点

3.1.7亲和色谱

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等) 

这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。