暗视场金相显微镜的原理及使用

   金相显微镜技术室利用斜射照明法阻挡透过标本的直射光，以反射光和衍射光来观察标本。在普通显微镜下直射光透过标本的时候，一部分光被吸收，另一部分光透射或折射，形成标本细节内部结构的真实投影。因此，在普通显微镜下所看到是物体形态和结构。而在金相显微镜下从侧面照射到物体的光束，绕射或反射成物体外形的侧影，因此暗视场显微镜下看到的只是物体的轮廓或物体的运动。

  通显微镜下可以看到0.4um的细节，而暗视场显微镜可以看到2.0-0.004um的极微小物体。这个范围的物体叫亚粒子。因此暗视场显微镜也可以称裂痕限外金相显微镜。

  视场显微镜特别适用于胶体化学领域观察溶质粒子的布朗运动，适用观察原虫、细菌的鞭毛、伪足运动，医学检验学范围适用于观察人体体液中螺旋体、尿管行、结晶或各种种子。在这一点上，暗视场显微镜远比其他显微镜优越得多。

一、部件

  视场金相显微镜的最关键部件是暗视野聚光镜

（一）抛物面聚光镜

      抛物面玻璃球体的上下两端平行切削而成的抛物面聚光镜，在它的下面中央的沉淀挡光薄膜，只允许其周边入射的照明光束。该光束在球体的抛物面上反射并会聚到标本上(图1)。

  图一、暗视场-抛物面聚光镜的光路                       图二、标本的反射光光路

       图二所示，一个人类红细胞膜反射的光束进入物镜前透镜成像的光路。在显微镜的视野中不允许进入直射光。因此视野应该全暗。自由物体所反射的光束造成闪的的物象（图三）

 图三 暗视野显微镜的视野与物象        （二）心形聚光灯

    将光学材料切削成球面反射系统，并以中光膜阻挡直射光的聚光镜为心形聚光灯（图四、图五）

（三）同心球面聚光镜

     利用两个球面的同一中心制造的聚光镜，基本原理都相同。这金属薄膜，只以球面反射面阻挡中心直射光（图六）

              图四  心形聚光灯                                          图五  心形聚光灯

（四）超聚光镜

     这是由两张中央球面凹陷的光学质料制成的超聚光镜。这种聚光镜适用于观察气体或液体标本内悬浮的微粒或微粒的布朗运动。当使用时将标本注入下面球形凹陷内，加以观察，此类聚光镜可以提高显微镜的分辨本领到0.004um，看到超微粒子（图七）

             图六  同心球形聚光静的光路                               图七  超聚光镜的光路

（五）简易的暗视野法

     如果未能购置专用的暗视野聚光镜时，可用黑纸裁剪小圆片，附在聚光镜下面阻挡中心直射光束，即可进行观察。

     可以利用全反射临射角（从光的密介质到光的疏介质时49°，从空气倒水时30-42°）的角度，投射带盖片的标本的盖片表面。这是斜射光束全反射而物体在黑暗中闪亮。

                     二、暗视场显微镜的使用方法

     暗视场观察时不能使用油镜系或水浸系物镜，而用干燥系物镜中镜口率0.85以下的物镜。假如使用镜口率过大的物镜时，除微粒子反射的光束中以外的旁射光束也可以进入物镜钱的透镜。就是这种放大率并不大的物镜下，也可以达到观察亚微粒子的要求。上海沪杏公司出售的带有孔栏的物镜最适于此用途。具体操作如下。

   1、安装暗视场聚光器   检查聚光器的光轴（并非晶体光轴而指几何光学光轴）是否与显微镜的光路一致。聚光镜用中心调节旋钮合轴之后，圆锥光束的交点集中到标本平面上为标准（图8）

图八、聚光镜的合轴标准（C）                               图九、暗视场聚光镜调焦标准

2 放置标本    放置标本时在聚光镜前透镜与载物片之间必须浸油。否则来自标本细节的反射光和衍射光束在载物片表面进行全反射。观察结果趋于失败。

3、调节聚光镜焦点   操作光源会聚透镜务使圆锥形光束的交点照射到标本平面上（图九）

4、选择物镜  用于暗视野观察的物镜中，油浸系或水浸系的物镜不使用。就是干燥系物镜中也要挑选镜口率在0.85以下的为好。如果物镜镜口率过大时，来自光聚光镜的部分直射光束进入物镜前透镜，从而干扰暗视场成像效应。如果使用油浸系物镜观察时，必须调节物镜内装孔径光阑。

5、光源的选择  暗视场显微镜中光能损失太大。因此必须选择光强最大的光源，才能取得较好的效果。尤其以超聚光镜观察胶体微粒运动时，光强愈大愈好。

6、浸油的方法  聚光镜与载玻片间浸油是特别注意是否有气泡。气泡可招致暗视场观察效果的完全破坏。