药物概念

肽酶是能分解蛋白短肽的酶类总称，大多存在于微生物细胞内，在发酵过程中当细胞自溶后，便释放肽酶水解肽类形成氨基酸，作为风味前体。他们是所有生物存活所必需的一种酶，而且在所有蛋白质的编码中，编码肽酶的基因占了2%。根据催化类型可将肽酶大致分成六类：丝氨酸型、苏氨酸型、半胱氨酸型、天冬氨酸型、谷氨酸型和金属离子型肽酶。而按照肽酶的EC系统推荐的作为所有蛋白水解酶的一般术语，可以分为两大类型，即内肽酶(E.C.3.4.21~3.4.99) 和外肽酶(E.C.3.4.11~3.4.19) ，具体的包括：氨肽酶、二肽酶、二肽基肽酶、肽基二肽酶、丝氨酸型羧肽酶、金属型羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸内肽酶、金属内肽酶、苏氨酸内肽酶、未知类型的内肽酶等[2][3]。

内肽酶

内肽酶，也就是通常所说的蛋白酶，主要作用于蛋白质多肽链内部的肽键使蛋白质长链分解成短肽片段。蛋白酶根据结构同源性分为不同的宗族，亚类进一步根据序列同源性程度分为不同的家族。

蛋白酶水解蛋白质时，作用部位因肽键种类而异。如胰蛋白酶的切点是羧基侧为碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）肽键；胃蛋白酶要求切点两端有芳香族氨基酸；枯草杆菌碱性蛋白酶要求切点的羧基侧为疏水性芳香族氨基酸（ 色氨酸、酪氨 酸、苯丙氨酸）。这种蛋白酶对切点的特异性要求叫做蛋白酶的底 物专一性。利用蛋白酶的底物专一性可以定向获得特殊结构的多肽[4]。

外肽酶

外肽酶广泛分布在动物、植物、微生物以及土壤中，在生物正常生理过程和病理生理过程都能起到重要的作用，主要涉及信号转导、肽类激素的调节、蛋白质结合和消化等过程。研究最多的氨肽酶是乳酸菌氨肽酶，已经从乳酸菌中分离纯化出100多种氨肽酶，但其他与食品发酵有关的微生物外肽酶的研究报道相对较少[3]。

外肽酶的分类

酶学委员会 (E. C.)列出了72种不同的外肽酶(http://www.expasy.ch/enzymes)。外肽酶只是在靠近多链的一侧末端起作用，在游离N端起作用的酶释放出单个的氨基酸残基、二肽或三肽（即分别为氨肽酶、二肽基肽酶和三肽基肽酶）；在游离C末端起作用的酶释放出单个的氨基酸残基（羧肽酶）或二肽(二肽基羧肽酶 )。其他外肽酶特异性水解二肽（二肽）或除去被异构肽键替换的、环化的，或交联的末端残基（即不是α羧基与α氨基的肽键）。

外肽酶的命名和性质特点E.C已经建立了从乳酸菌氨肽酶发展起来的微生物氨肽酶系统命名法。对于认识尚未达到基因水平的按照其生化名字或缩写，其后按发现的顺序编号，如Lep、和。如果认识已达到基因水平，就用Pep命名，其后跟上表示特征的词的首字母，如Pep N。它是一种金属氨肽酶，较适于作用N-末端含有脂肪族或带负电荷的残基 (Lys，Arg，Leu) ，但是不能作用于含有Pro的肽。谷氨酰胺肽酶和Pep A较适于作用N-末端为Glu和Asp的肽。二肽酶，如Pep D 和Pep V，均表现出对N-末端大的疏水性氨基酸残基的特异性。

亮氨酸氨肽酶对含有疏水性氨基酸末端残基的底物具有广泛特异性。然而，它对N-末端含有精氨酸、赖氨酸或脯氨酸的肽作用很弱。大多数氨肽酶的最适pH在中性范围，最适温度范围37~50。植物和动物来源的氨肽酶平均分子量大于100 kDa。氨肽酶的活性会受到Bestain的抑制，抑制的程度随着蛋白质浓度和处理时间的增加而加强。

绝大多数羧肽酶是金属羧肽酶，一般都是单个多肽链。相对于氨肽酶来说，羧肽酶具有较广的最适pH范围(4~8.5)和最适温度(25~80)。与氨肽酶命名相比，羧肽酶的命名还没有统一的说法，可以根据来源和发现的顺序进行命名，如羧肽酶Y(酵母)、羧肽酶W(小麦)等。也有根据酶对底物作用的特性来命名，如Gly-Xaa羧肽酶、丝氨酸型D-Ala-D-Ala羧肽酶等。由于二者都属于蛋白酶，多数氨肽酶和羧肽酶的活性都会受到EDTA或1，10-邻菲啰啉的抑制，而合成的赖氨酰丙氨酸比EDTA对含锌的羧肽酶A抑制作用更强[3]。

外肽酶的结构

氨肽酶的结构

许多氨肽酶是锌金属酶类，锌离子与底物的配基有关。多数微生物氨肽酶是单链多肽，其他的含有2、4或6个亚基。一些氨肽酶和羧肽酶含有糖，但都不含脂蛋白。X射线结晶方法揭示了牛晶状体LAP的三维结构，表明它是一种在活性部位含有2个锌离子的金属酶，而哺乳动物间LAP具有结构相似性，不过也发现牛晶状体LAP和恶臭假单胞菌氨肽酶(ppLAP)之间及其相似，尤其是大肠杆菌和酿酒酵母LAP与牛晶状体LAP有显著的氨基酸序列同源性。酿酒酵母氨肽酶1(Ape1)是一种货物蛋白，在液泡中成熟形式为Ape1 (mApe1)，以四面体十二聚合物形式存在。

羧肽酶的结构

对于羧肽酶结构的认识，人们较为熟悉的是CPA和CPB的三维晶体构型。X射线扫描结果表明，牛CPA与CPB的结构十分相似。CPA存在于哺乳动物胰脏中，分子质量34.6 kD，每个酶分子含有1个Zn离子作为辅基，酶蛋白是单一的多肽链，约有300个氨基酸残基。牛CPB分子也含有1个Zn离子，肽链有308个氨基酸残基，其中49%的氨基酸顺序与羧肽酶A相同，三维结构也非常相似。与Zn离子配位的氨基酸残基是His69、Glu72和His196，其催化活性部位包括束缚C-末端羧基的Arg145、作用于肽键的Glu270和Tyr248。不同的是，CPB的活性部位还包括Asp255，而CPA的Ile255不是活性部位。CPB的三斜晶体结构显示，Tyr248朝向溶剂水分子暴露，从而使该酶的疏水性和亲水性之间存在细微的平衡，甚至会影响到底物结合以及酶的动力学效率。根据酶的结构差异，金属羧肽酶分为两大类：Cowrins和Funnelins类，Cowrins类由原生动物、原核细胞和哺乳动物酶组成，都与溶神经素和血管紧张素转移酶有关，其催化域残基数为500～700，参与底物绑定的结构中含有1个由17个螺旋和1个3股的β-折叠片层。而Funnelins类包括和原型牛羧肽酶A1结构相关的蛋白以及具有特定羧肽酶活性的哺乳动物、昆虫和微生物蛋白，其催化域内的残基数在300个以内，而且每边8个螺旋上侧面叠有一个八股β-折叠片层。Occhipinti等通过定位突变和小角度X射线扫描技术证实了建立分子模型来研究硫化叶菌羧肽酶的三维结构的可行性和条件[5]。

反应特性

所有的外肽酶作用的底物N-末端必须有1个游离的氨基，或者C-末端必须有1个游离的羧基，或者两种结构都需要，而且，外肽酶从肽链末端水解1个肽键时，释放的残基不会多于3个。多肽末端的特定氨基酸、与肽键相邻的氨基酸残基的性质、多肽链的结构和长度共同决定外肽酶的活性。大多数氨肽酶的最适pH值在中性范围，最适温度介于37～50；与前者相比，羧肽酶具有较宽的作用pH值范围(4.0～8.5)和较宽的温度范围(25～80)[5]。