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分子生物学/蛋白组学/细胞生物学/免疫检测/生化试剂专题

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2.1 蛋白样品的提取

2.1.1 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白

    水溶液提取法：针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。

    有机溶剂提取法：对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。

2.1.2 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白

2.1.3 裂解液的选择

 根据检测蛋白位置选择合适的裂解液

2.2 蛋白样品的定量

    目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。

    收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大，大家可以根据具体情况选取。

   Bradford法（考马斯亮蓝法）

   考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。

该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂对测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。

   Lowry法（Folin-酚试剂法）

   福林-酚试剂（Folin-phenol reagent）的显色原理是：首先在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物，该复合物随之将磷钼酸-磷钨酸还原成蓝色复合物。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质量成正比，蛋白质浓度范围约在25～250 μg/mL。

 虽然该法是测定蛋白质浓度应用最广泛的方法之一，但其缺点也很明显，专一性较差，干扰物质多（如Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化物、酚类、柠檬酸等），标准曲线的直线关系不特别严格。因此在其应用过程中有很多新的修正。

   BCA法（二喹啉甲酸法）

    二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA )法是Lowry测定法的一种改进方法，是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性条件下蛋白质分子中的肽键能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

   与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法操作更简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性更好，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

   BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。

2.3 蛋白样品的变性

SDS：

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• 阴离子去污剂、变性剂
• 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。
• 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。
• 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。

蛋白质-SDS胶束的特点：

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   （1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒
   （2）平均1 g蛋白质结合1.4 g SDS

   （3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的

   （4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比