PCR常见问题及对策；（一）没有得到扩增产物；（1）酶失活或在反应体系中未加入酶；（2）模板含有杂质；（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温；（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加T；（5）引物变质失效；（6）使用PCR试剂盒时还应注意：①是否严格按照；（1）酶量过高；（4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短；①凝胶中缓冲液和电泳缓

PCR常见问题及对策

（一）没有得到扩增产物

（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5－10分钟。

（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

（6）使用PCR试剂盒时还应注意： ①是否严格按照说明书操作； ②试剂使用前是否充分混匀； ③试剂储存过久或不当而失效。 （二）扩增产物在凝胶中涂布或成片状

（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。 （2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。 （3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。

（4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。 （5）退火温度过低。 （6）电泳体系有问题：

①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大； ②凝胶没有凝固好； ③琼脂糖质量差。

（7）若为PCR试剂盒则可能： ①由于运输储存不当引起试剂盒失效；

②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。 （8）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。 （三）溴酚蓝前有区带（很宽）

（1）模板量太低。增加模板DNA的用量。 （2）循环次数太多。减少循环次数。 （3）复性度偏低。提高复性温度。 （4）预变性后没有立刻上机循环。

（5）引物3'端是否互补；重新设计合成较长的引物。 （6）引物用量偏多。降低引物的使用量。 （四）扩增产物出现多条带

（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。    （2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。 （5）样品处理不当。

（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。 （7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

（五）PCR假阳性结果

（1）引物设计不当，应调换引物。

（2）循环参数不合适，导致非特异性扩增。

（3）靶序列的交叉污染。

（六）PCR假阴性结果

（1）引物长度不够。

（2）试剂浓度不标准。

（3）靶序列如突变、缺失等。

（4）循环参数设置错误。

（5）标本中有Taq酶抑制剂。

（6）PCR产物检测系统灵敏度不够。

减少引物二聚体的方法

1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；

2. 可能模板有问题；

3. 模板浓度过小，适当加大模板量；

4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度； 5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；

6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性； 7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。 8. 增加循环数；

9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；

10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。

11. 以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异

性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍