加载中…核磁共振谱分析蛋白质-蛋白质相互作用（方法及注释）
(2018-10-19 09:11:51)| 分类： 分子间相互作用 |
3方法
3.1NMR样品制备
表达Raf-CRD的谷胱甘肽S转移酶( glutathione Stransferase,GST)融合蛋白(第13章),用亲和层析法纯化。纯的富含N的Raf-CRD蛋白从99.8NHCl( Isted,Miamisburg,OH)作为唯一氮源的低营养培养基里生长的大肠杆菌获得。纯化的蛋白质浓缩在2m130mmol/ L Tris acetate溶液E(pH 6.5, E 75mmol/L Na2 SO4, 10umol/L ZnCl2, 1mmol/LDDT)。然后用一个 Amersham PD-10凝胶过滤柱将溶液转换到NMR缓冲液中[在pH6.5的100mmo/ L NaCl,10pmol/LznC2,lmmol/L d-DTT,10O,0.01%NaN2中溶解30mmod11-Tris-d3- acetate( Isotec, Miamisburg,OH)](见注释4所有NMR样品的终体积都为500。Raf- CRD NMR样品含有0.28mmol/L富含1N的纯Raf-CRD,或者与浓度在0.30~0.77mmol/L的野生型未标记的Ras混合。
3.2NMR谱
核磁共振仪如用 Bruker AMX500(500MHz)需在12进行实验,如用 Varian Inova600(600MHz)则需要在25进行实验(见注释5)。用二维H-15N异核单量子相关谱仪( heteronuclearsingle quantum correlation,HSQC)的实验采用了脉冲场梯度和水翻滚( water flip-back)方法0(见注释6、7)。在 BrukerAMX500仪器上数据以1024×256复合数据点采集,其谱宽为H维7042.25Hz,而N维1000Hz。在 Varian Inova600仪器上进行的HSQC实验则以1024×128复合数据点采集,H维的谱宽为8000Hz,N维的谱宽为1700Hz。数据的处理和分析使用的是FELX程序( Accelrys, San Diego,CA)(见注释8)。
3.3NMR化学位移滴定
Raf-CRD的质子和N共振谱已由本实验室确定5。RafCRD-Ras复合物以4种不同的摩尔比来进行其二维H-15 N HSQC数据的采集:1:2.75,1:1.65,1:1.1和1:0。15N-RaCRD的终浓度是0.28mm/L,而未标记的Ras的浓度范围为0.77~0.30mmol/L。首先制备的样品只含有最高摩尔比(1:2.75)的Raf-CRD-Ras复合物(0.28mmol/L:0.77mmol/L)以及Raf-CRD(0.28mmol/L)。为了避免样品体积和缓冲液成分改变,制备另外两个复合物(摩尔比1:1.65和1:1.1)时,通过分别交换20011的含有最高摩尔比(1:2.75)和单独样品(1:0)使终体积为500l
用荧光结合分析法来确定Ra-CRD和Ras结合的亲和力大小。由于溶解度的限制,K。值不能够被准确测定。然而,我们计算的K为3001mol/L,这表明Raf-CRD和Ras结合相互作用很可能在NMR时间尺度是快交换反应。滴定过程中,我们期望看到代表游离态和结合态重量比的峰只有一个。假定Ras/Raf-CRD相互作用的K值为300mo1/L,那么NMR实验就是在大约0-6%结合率的条件下进行的,而且化学位移最大程度变化(完全饱和结合)的数据将采集不到。然而,如果我们估计的K值低,则结合率将会小于66%。对于达到饱和结合的滴定来说,尽管化学位移变化比预计值要小,但是这些实验给出的化学位移变化还是足以描绘结合界面。
3.4数据分析
为了阐明对Ras结合起重要作用的Raf-CRD残基,我们分析了与Ras结合富含15N的Raf-CRD相关的H-1 N HSQC NMR谱的变化。H- N HSQC实验将给出一个谱图,其中一维含有质子化学位移,而另外一维含有共价结合的1N原子核的化学位移,因此只能观察到与富含15N的Raf-CRD相对应的谱峰。被测得各种HN共振中有一部分是氨基质子。因此,HSQC谱峰像位点特异探针提供了Raf-CRD中除脯氨酸之外每个残基的信息。图5-1显示了加入Ras(摩尔比为1:2.75)之后Raf-CRD的NMR谱的变化,该图为N标记的Raf-CRD在有(黑色)和没有(灰色)未标记的Ras存在下的部分H- N HSQC谱的叠加。标记出了H和化学位移和(或)峰强度发生显著变化的Ra-CRD残基
(见注释9)。如果谱峰位置变化小于H谱线的宽度则这样的化学位移变化被认为是没有意义的。大多数观察到的游离Raf-CRD和复合物之间的化学位移差是位于Raf-CRD的144145、148~150158-164以及174~176残基处。在144、145、148~150、158~160、174和175残基处可观察到最大H化学位移变化。161、13164和176残基的化学位移变化较小。剩余谱峰的H化学位移的平均变化都小于谱线宽度,表明Raf-CRD与Ras结合后并没有改变其整体结构(见注释10)。在N化学位移变化中也观察到了相同的趋势。在有或没有2.75倍的过量Ras的情况下,在145、148149、158、163以及175残基可见最大化学位移,在136、150162、174和183残基处化学位移变化较小。有许多峰都表现出强度降低(大约55%),这很可能反映了与Ras蛋白相互作用还存在的另外的弛豫机制。氨基的最大峰强度变化是在141、145148~150、158和170残基。图5-2标示出了Raf-CRD与Ras结合后,在HSQC谱图中表现出明显化学位移和(或)峰强度变化的残基位点。可以清楚地看到,位于分子顶部的148~150和158164残基是结合界面的一部分。同样,在体外实验1149T/F151QRa-CRD突变体与Ras结合的亲和力下降。另外,在体实验显示当全长Raf发生Ll49T/F151Q突变,Ras介导的Raf激活就会减弱(3。虽然在Raf-CRD144-145和174-177残基的共振中也观察到了谱图的变化,但K144和T178突变并不影响与Ras的结合(未发表的数据)。所观察到的这些与残基相关的谱图变化可以反映出由于Ras的结合而对相邻残基的间接影响而造成残基化学环境的变化(见注释11)。
4注释
4. 化学位移成像研究通常在90%H2O/10O中进行,以观察蛋白质中易变质子如氨基质子。D2O是必需的,因为这样才能有足够的氘信号使NMR锁定系统发挥功能。如果可能,NMR缓冲液的总盐浓度应小于500m,如果盐浓度F高可能会引起NMR探头的钝化而导致灵敏度降低。缓冲液中的任何有机成分,如Tris和醋酸盐,当其浓度超过500mol/L时,都应进行氘代,以避免背景质子信号。许多人使用不含质子的缓冲液(如磷酸盐),来避免由于缓冲液介质的同位素富集而带来的额外花费。对于液体样品,经常使用一个终浓度小于50mo/L的化学位移内标,如5,5dimethylsilapentanesulfonate(DSS)或者3,3,3rimethylsilylpropionate(TSP)。可以在NMR缓冲液中加NaN3(<50mol/L)抑制细菌生长,以防止NMR样品降解。通常在NMR样品中加入50mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)来络合顺磁离子,因为如果顺磁杂质,如Fe3+和Mn2+一旦与蛋白质相互作用,就会引起化学位移和弛豫时间的巨大变化。溶解的顺磁离子还能引起水信号变宽,这将严重影响溶酶抑制。
5. 在NMR滴定过程中,生物大分子必须稳定,确保样品在实验过程中没有发生改变是非常重要的,这就要采集一个快速1DH或2DH-15 N HSQO谱图并将其与对照样品的谱图相比较。如果谱图一致,则说明样品没有改变
6. 为了提高异核(非质子核)的灵敏度,有两个解决办法:是像上面描述的那样对蛋白质中的异核进行同位素富集,二是用被称作反向NMR的实验来提高S/N,其中磁化从质子传递到异核。在生物分子NMR应用中,广泛使用的反向NMR是HSQC。H- N HSQC谱图把NH的氮原子与直接相连的质子联系起来,从而给出蛋白质的指纹谱除脯氨酸之外,每个氢基酸带人使用不含质子的级用一个终浓度小于501mo/L的化学位移内标,如5,5dimethylsilapentanesulfonate(Dss)或者3,3,3rimethylsilylpropionate(TsP)。可以在NMR缓冲液中加NaN3(<50mo/L.)抑制细菌生长,以防止NMR样品降解。通常在NMR样品中加入50mo/L乙二胺四乙酸(EDTA)来络合顺磁离子,因为如果顺磁杂质,如Fe+和Mn2+一旦与蛋白质相互作用,就会引起化学位移和弛豫时间的巨大变化。溶解的顺磁离子还能引起水信号变宽,这将严重影响溶酶抑制
7. 对于精细结构的研究,NMR所能研究的分子大小始终受到限制,尽管在过去10年中,由于更强大的NMR谱仪、冷冻探头以及更为复杂的脉冲序列技术的出现,分子大小的上限已经得到了显著的提高,已从1992年的约20kD提高到2002年的约70kD。在给定的谱宽大分子会有更多的NMR信号,从而使谱图中会有更多的重叠,因而增加谱图的复杂性。另外,由于共振线宽与分子的转动相关时间te成正比,大分子的每个共振的线宽也增加。分子越大,其τ越长,因而线宽更宽。TROSY方法选择的是最长的弛豫组分,使得HSQC的谱线更窄,检测灵敏度更高。因此, TROSY-HSQC技术可以用于大分子(>60kD)的NMR化学位移成像,事实上,TROSY技术已经成功地应用于分子量大到900kD蛋白质的研究。
8. NMR信号被称为自由感应衰减( free induction decay,FID)。FID是一个时间域的信号,包含一系列作为时间函数的正弦/余弦波,并且以指数速率衰减。用ADC仪器(模拟-数字转换器, analog-to- digital converter)按照时间间隔对信号强度进行采样,并以整数值将信号强度存储在计算机里,如此FID的数字化就完成了。典型的数据处理包括:将FD原始数据从核磁共振谱仪的格式转换成处理程序格式;对传统的FID进行切趾法处理( apodization)。切趾法指的是对FI进行处理以提髙其信噪比或分辨率。通常是通过对FID使用合适的函数窗来完成。典型的函数窗是90°正弦钟形函数;对FD进行补零(zero- filling),即做傅立叶变换之前,在FID末端加上数值为零的数据点,以使在谱图中产生更多的数据点;通过傅立叶变换将时域信号转换为频域谱图;调整谱图相位以产生对称峰或 Lorenzian峰;然后进行基线校正和谱图标注。对于2,3,4维的数据,每一维都要重复十而的计和日前有许多程序能够做NMR数据处理和(或)谱图可视化与分析,其中不少程序市面上都有销售,如 FELIX( Accelrys, San Diego,CA)和SYBYTRIAD( Tripos Inc.,St. Louis,MO),还有供学术研究使用的免费程序如美国国立卫生院(NIH)的 NMRPipe和NMRDraw, Merck Research Laaboratories出品的 NERVi以及UCSF出品的 Sparky。
9. 氨基峰的谱图变化大小可以用 Pythagorean关系定量表示NH=[H+(N/6)2]2,其中H和N是某一特定氨基峰化学位移变化,以每百万中的份数(ppm)表示。
10. 有些蛋白质,在与配体结合时会发生构象变化。因此,随着结合配体的加入,位于结合界面以外的其他谱峰也会发生位移。这就使得通过化学位移成像来确定相互作用表面变得十分困难。幸而还可以使用别的方法来确定相互作用表面。例如观察分子间的NOE。如果观察到远距离影响,而且,蛋白质并没有随着配体的结合发生大的构象变化,那么氢交换速度的测量,以及描绘主链或侧链动态的变化,也是有用的。我们使用弛豫试剂来对相互作用界面进行成像,结果非常成功1在这种方法中,可溶顺磁试剂或称弛豫试剂[如羟基TEMPO以及络合的钆()]能够“漂白”暴露于溶剂中的NMR信号。这些试剂中所含的未成对电子能够通过瞬间双极相互作用与蛋白质中的原子核相互作用,从而有效地扩宽来自蛋白质表面残基的质子共振。在有或没有被测蛋白质的结合配体的情况下,比较蛋白质的H-5 N HSQC谱图中由顺磁探针所产生的谱线变宽效应,已被证明是一种描述分子间相互作用界面的方便而有效的方法
最近我们实验室尝试过利用化学位移成像技术来确认由paxi(LD2)推断而来的肽段和黏着斑激酶(oaltadhesion kinase.FAK的着斑靶域targeting domain,FAT)之间的相互作用位点。由于肽段的加入引起了FAT序列中大多数残基的剧烈的化学位移,这一实验失败了。这可能是由于在FAT蛋白中存在着两个肽结合位点(已投稿)。作为一个替换策略,Gd()-EDTA被用作顺磁探针来对结合界面进行成像。在含有20mmol/L全氘化的Tris马来酸盐、50mmol/l.NaCl、0.1mmol/ L EDTA、10O,并有不同浓度的1:1Gd()-EDTA复合物(最大浓度为9mmol/L)的缓冲液中,对0.1~0.2mmol/LN标记的FAT样品[单独或与LD2肽段混合(摩尔比1:8)]进行分析。采集其2DH-15 N HSQO谱。以在给定浓度的Gd()-EDTA下测定的NH峰高与没有顺磁表面探针存在下测定的峰高的比值来测量谱线宽度变化。从在3mmolLGd()-EDTA存在下的FAT蛋白质/ paxillin肽段复合物的标准化NH峰高中减去在同样条件下游离FAT蛋白质的标准化NH峰高。被高度保护的氨基质子位于FAT两个表面的两个疏水片段。这些结果与等温滴定热量测定数据非常一致,而且为FAT/ paxillin复合物的双结合位点模型提供了进一步的证据。然而,研究显示:镧系元素复合物倾向于与羧基紧密结合,而硝酰基倾向于与疏水表面的残基结合2,因此有可能发生顺磁探针与蛋白质的非特异性相互作用。这两种试剂的联合使用可以互补进而得到更有意义的结果
11. 我们讲述的这个实例是Ras蛋白和 Raf-CRD片段弱相互作用的例子,他们的结合在NMR时间尺度上属于快交换。但是,NMR化学位移成像技术一般用于研究结合力强的相互作用。如前文提到的,对于Kd<1mol/L的复合物,是属于NMR时间尺度的慢交换,将会观察到标记蛋白质的游离态和结合态两组不同的谱峰。因为NMR谱图一般是在01mmol/L的样品浓度下采集的,所有配体将会以亚化学计量的浓度与蛋白质结合。往往在滴定前,游离态的共振标定谱就已经知道,而结合态的并不知。对谱图的分析需要知道对代表着随配体结合而消失的游离态谱峰的特点。对结合界面谱峰的变化进行解析可能比较难,尤其是当游离态和结合态之间的化学位移变化由于谱峰重叠而难以区分时。在这种情况下,可能只能对那些位移较大的共振进行解析从而粗略地描述结合界面,或者,先获得结合态的共振标定谱,从而更精确地描绘出哪个共振因配体结合受到了扰动。
3.1NMR样品制备
表达Raf-CRD的谷胱甘肽S转移酶( glutathione Stransferase,GST)融合蛋白(第13章),用亲和层析法纯化。纯的富含N的Raf-CRD蛋白从99.8NHCl( Isted,Miamisburg,OH)作为唯一氮源的低营养培养基里生长的大肠杆菌获得。纯化的蛋白质浓缩在2m130mmol/ L Tris acetate溶液E(pH 6.5, E 75mmol/L Na2 SO4, 10umol/L ZnCl2, 1mmol/LDDT)。然后用一个 Amersham PD-10凝胶过滤柱将溶液转换到NMR缓冲液中[在pH6.5的100mmo/ L NaCl,10pmol/LznC2,lmmol/L d-DTT,10O,0.01%NaN2中溶解30mmod11-Tris-d3- acetate( Isotec, Miamisburg,OH)](见注释4所有NMR样品的终体积都为500。Raf- CRD NMR样品含有0.28mmol/L富含1N的纯Raf-CRD,或者与浓度在0.30~0.77mmol/L的野生型未标记的Ras混合。
3.2NMR谱
核磁共振仪如用 Bruker AMX500(500MHz)需在12进行实验,如用 Varian Inova600(600MHz)则需要在25进行实验(见注释5)。用二维H-15N异核单量子相关谱仪( heteronuclearsingle quantum correlation,HSQC)的实验采用了脉冲场梯度和水翻滚( water flip-back)方法0(见注释6、7)。在 BrukerAMX500仪器上数据以1024×256复合数据点采集,其谱宽为H维7042.25Hz,而N维1000Hz。在 Varian Inova600仪器上进行的HSQC实验则以1024×128复合数据点采集,H维的谱宽为8000Hz,N维的谱宽为1700Hz。数据的处理和分析使用的是FELX程序( Accelrys, San Diego,CA)(见注释8)。
3.3NMR化学位移滴定
Raf-CRD的质子和N共振谱已由本实验室确定5。RafCRD-Ras复合物以4种不同的摩尔比来进行其二维H-15 N HSQC数据的采集:1:2.75,1:1.65,1:1.1和1:0。15N-RaCRD的终浓度是0.28mm/L,而未标记的Ras的浓度范围为0.77~0.30mmol/L。首先制备的样品只含有最高摩尔比(1:2.75)的Raf-CRD-Ras复合物(0.28mmol/L:0.77mmol/L)以及Raf-CRD(0.28mmol/L)。为了避免样品体积和缓冲液成分改变,制备另外两个复合物(摩尔比1:1.65和1:1.1)时,通过分别交换20011的含有最高摩尔比(1:2.75)和单独样品(1:0)使终体积为500l
用荧光结合分析法来确定Ra-CRD和Ras结合的亲和力大小。由于溶解度的限制,K。值不能够被准确测定。然而,我们计算的K为3001mol/L,这表明Raf-CRD和Ras结合相互作用很可能在NMR时间尺度是快交换反应。滴定过程中,我们期望看到代表游离态和结合态重量比的峰只有一个。假定Ras/Raf-CRD相互作用的K值为300mo1/L,那么NMR实验就是在大约0-6%结合率的条件下进行的,而且化学位移最大程度变化(完全饱和结合)的数据将采集不到。然而,如果我们估计的K值低,则结合率将会小于66%。对于达到饱和结合的滴定来说,尽管化学位移变化比预计值要小,但是这些实验给出的化学位移变化还是足以描绘结合界面。
3.4数据分析
为了阐明对Ras结合起重要作用的Raf-CRD残基,我们分析了与Ras结合富含15N的Raf-CRD相关的H-1 N HSQC NMR谱的变化。H- N HSQC实验将给出一个谱图,其中一维含有质子化学位移,而另外一维含有共价结合的1N原子核的化学位移,因此只能观察到与富含15N的Raf-CRD相对应的谱峰。被测得各种HN共振中有一部分是氨基质子。因此,HSQC谱峰像位点特异探针提供了Raf-CRD中除脯氨酸之外每个残基的信息。图5-1显示了加入Ras(摩尔比为1:2.75)之后Raf-CRD的NMR谱的变化,该图为N标记的Raf-CRD在有(黑色)和没有(灰色)未标记的Ras存在下的部分H- N HSQC谱的叠加。标记出了H和化学位移和(或)峰强度发生显著变化的Ra-CRD残基
(见注释9)。如果谱峰位置变化小于H谱线的宽度则这样的化学位移变化被认为是没有意义的。大多数观察到的游离Raf-CRD和复合物之间的化学位移差是位于Raf-CRD的144145、148~150158-164以及174~176残基处。在144、145、148~150、158~160、174和175残基处可观察到最大H化学位移变化。161、13164和176残基的化学位移变化较小。剩余谱峰的H化学位移的平均变化都小于谱线宽度,表明Raf-CRD与Ras结合后并没有改变其整体结构(见注释10)。在N化学位移变化中也观察到了相同的趋势。在有或没有2.75倍的过量Ras的情况下,在145、148149、158、163以及175残基可见最大化学位移,在136、150162、174和183残基处化学位移变化较小。有许多峰都表现出强度降低(大约55%),这很可能反映了与Ras蛋白相互作用还存在的另外的弛豫机制。氨基的最大峰强度变化是在141、145148~150、158和170残基。图5-2标示出了Raf-CRD与Ras结合后,在HSQC谱图中表现出明显化学位移和(或)峰强度变化的残基位点。可以清楚地看到,位于分子顶部的148~150和158164残基是结合界面的一部分。同样,在体外实验1149T/F151QRa-CRD突变体与Ras结合的亲和力下降。另外,在体实验显示当全长Raf发生Ll49T/F151Q突变,Ras介导的Raf激活就会减弱(3。虽然在Raf-CRD144-145和174-177残基的共振中也观察到了谱图的变化,但K144和T178突变并不影响与Ras的结合(未发表的数据)。所观察到的这些与残基相关的谱图变化可以反映出由于Ras的结合而对相邻残基的间接影响而造成残基化学环境的变化(见注释11)。
4注释
1.
NMR化学位移成像一般使用同位素NMR方法。质子是在生物大分子研究中最为重要的磁活性原子核,这是因为它有着最高的自然丰度(9.98%),并且对于NMR检测方法最为敏感。质子检测对于通过NOE定量测定质子间的距离也是非常必要的。然而,单独使用质子的方法对于分子量大于10~15kD蛋白质的NMR分析并不适用。除了质子,蛋白质还包含其他的磁活性原子核。对于蛋白质的NMR来说,N和C具有特殊的重要意义,因为这些NMR活性原子核可被用于较大蛋白质的探测和共振定量。1N(0.37%)和C(1.108%)的天然丰度很低,它们的环磁比分别比质子的小10倍和4倍。对于较大蛋白质,必须使用稳定同位素标记来增强天然低丰度的原子核信号而提高检测灵度。只要能够由标记前体[如NH4C或5(NH4)2SO]制备出高产率的蛋白质,稳定的同位素标记不一定十分昂贵。这种花费常常能够换来谱图的显著简单化以及同位素富集的蛋白质样品的额外信息。此外,1C和N都不具有放射性,因此在它们的使用过程中不存在安全风险
2.
由于NMR本身灵敏度很差,制备一个样品所需的量依生物化学的标准来看经常是很大的。蛋白质-蛋白质相互作用研究中所使用蛋白质的浓度通常在0.1~1mmol/L。然而,近年来的技术进步如高磁场(900MHz,1GHz)和冷冻探头大幅度地提高了检测灵敏度,使得在微摩尔浓度范围用NMR研究蛋白质成为可能。鉴于NMR灵敏度的限制,NMR信号通常要平均许多次来提高信噪比(
signal to
noisewratio,s/Nratio)。信噪比随着信号平均次数平方根的增加而增加,因此,获得同样灵敏度的谱图用0.5mmol/L的样品所需测试时间是1mmol/L样品的4倍。对于通常使用的5mNMR样品池,理想的样品体积应该是500左右(对于特殊的
ShigemiNMR样品池是3501)。随着蛋白质分子量的不同,需要的蛋白质从几毫克到几十毫克不等。例如,需要5mg的10kD蛋白质来制备50011mmol/L的样品,应用DNA重组技术是可以实现的。在实验中,纯化足够量的蛋白质样品并不是唯一的困难。在毫摩尔浓度下,许多生物分子具有不利的聚集或溶解特性。需要调整pH、蛋白质和(或)盐浓度,以获得适于NMR分析的稳定溶液
3.
NMR样品池应用水和(或)有机溶剂(如丙酮)进行清洗。丙酮可挥发掉,或者用去离子水彻底冲洗样品池。为了避免刮伤NMR样品池的内壁,不应使用毛刷或其他摩擦性材料。NMR样品池可在低于125下干燥30~40min,或者用干燥氮气将其吹干(去除残余丙酮)。对于更加困难的清洗问题,可先使用硝酸,再用蒸馏水或丙酮冲洗。但是不能使用铬酸,因为铬酸可能产生氧化顺磁副产物4. 化学位移成像研究通常在90%H2O/10O中进行,以观察蛋白质中易变质子如氨基质子。D2O是必需的,因为这样才能有足够的氘信号使NMR锁定系统发挥功能。如果可能,NMR缓冲液的总盐浓度应小于500m,如果盐浓度F高可能会引起NMR探头的钝化而导致灵敏度降低。缓冲液中的任何有机成分,如Tris和醋酸盐,当其浓度超过500mol/L时,都应进行氘代,以避免背景质子信号。许多人使用不含质子的缓冲液(如磷酸盐),来避免由于缓冲液介质的同位素富集而带来的额外花费。对于液体样品,经常使用一个终浓度小于50mo/L的化学位移内标,如5,5dimethylsilapentanesulf
5. 在NMR滴定过程中,生物大分子必须稳定,确保样品在实验过程中没有发生改变是非常重要的,这就要采集一个快速1DH或2DH-15 N HSQO谱图并将其与对照样品的谱图相比较。如果谱图一致,则说明样品没有改变
6. 为了提高异核(非质子核)的灵敏度,有两个解决办法:是像上面描述的那样对蛋白质中的异核进行同位素富集,二是用被称作反向NMR的实验来提高S/N,其中磁化从质子传递到异核。在生物分子NMR应用中,广泛使用的反向NMR是HSQC。H- N HSQC谱图把NH的氮原子与直接相连的质子联系起来,从而给出蛋白质的指纹谱除脯氨酸之外,每个氢基酸带人使用不含质子的级用一个终浓度小于501mo/L的化学位移内标,如5,5dimethylsilapentanesulf
7. 对于精细结构的研究,NMR所能研究的分子大小始终受到限制,尽管在过去10年中,由于更强大的NMR谱仪、冷冻探头以及更为复杂的脉冲序列技术的出现,分子大小的上限已经得到了显著的提高,已从1992年的约20kD提高到2002年的约70kD。在给定的谱宽大分子会有更多的NMR信号,从而使谱图中会有更多的重叠,因而增加谱图的复杂性。另外,由于共振线宽与分子的转动相关时间te成正比,大分子的每个共振的线宽也增加。分子越大,其τ越长,因而线宽更宽。TROSY方法选择的是最长的弛豫组分,使得HSQC的谱线更窄,检测灵敏度更高。因此, TROSY-HSQC技术可以用于大分子(>60kD)的NMR化学位移成像,事实上,TROSY技术已经成功地应用于分子量大到900kD蛋白质的研究。
8. NMR信号被称为自由感应衰减( free induction decay,FID)。FID是一个时间域的信号,包含一系列作为时间函数的正弦/余弦波,并且以指数速率衰减。用ADC仪器(模拟-数字转换器, analog-to- digital converter)按照时间间隔对信号强度进行采样,并以整数值将信号强度存储在计算机里,如此FID的数字化就完成了。典型的数据处理包括:将FD原始数据从核磁共振谱仪的格式转换成处理程序格式;对传统的FID进行切趾法处理( apodization)。切趾法指的是对FI进行处理以提髙其信噪比或分辨率。通常是通过对FID使用合适的函数窗来完成。典型的函数窗是90°正弦钟形函数;对FD进行补零(zero- filling),即做傅立叶变换之前,在FID末端加上数值为零的数据点,以使在谱图中产生更多的数据点;通过傅立叶变换将时域信号转换为频域谱图;调整谱图相位以产生对称峰或 Lorenzian峰;然后进行基线校正和谱图标注。对于2,3,4维的数据,每一维都要重复十而的计和日前有许多程序能够做NMR数据处理和(或)谱图可视化与分析,其中不少程序市面上都有销售,如 FELIX( Accelrys, San Diego,CA)和SYBYTRIAD( Tripos Inc.,St. Louis,MO),还有供学术研究使用的免费程序如美国国立卫生院(NIH)的 NMRPipe和NMRDraw, Merck Research Laaboratories出品的 NERVi以及UCSF出品的 Sparky。
9. 氨基峰的谱图变化大小可以用 Pythagorean关系定量表示NH=[H+(N/6)2]2,其中H和N是某一特定氨基峰化学位移变化,以每百万中的份数(ppm)表示。
10. 有些蛋白质,在与配体结合时会发生构象变化。因此,随着结合配体的加入,位于结合界面以外的其他谱峰也会发生位移。这就使得通过化学位移成像来确定相互作用表面变得十分困难。幸而还可以使用别的方法来确定相互作用表面。例如观察分子间的NOE。如果观察到远距离影响,而且,蛋白质并没有随着配体的结合发生大的构象变化,那么氢交换速度的测量,以及描绘主链或侧链动态的变化,也是有用的。我们使用弛豫试剂来对相互作用界面进行成像,结果非常成功1在这种方法中,可溶顺磁试剂或称弛豫试剂[如羟基TEMPO以及络合的钆()]能够“漂白”暴露于溶剂中的NMR信号。这些试剂中所含的未成对电子能够通过瞬间双极相互作用与蛋白质中的原子核相互作用,从而有效地扩宽来自蛋白质表面残基的质子共振。在有或没有被测蛋白质的结合配体的情况下,比较蛋白质的H-5 N HSQC谱图中由顺磁探针所产生的谱线变宽效应,已被证明是一种描述分子间相互作用界面的方便而有效的方法
最近我们实验室尝试过利用化学位移成像技术来确认由paxi(LD2)推断而来的肽段和黏着斑激酶(oaltadhesion kinase.FAK的着斑靶域targeting domain,FAT)之间的相互作用位点。由于肽段的加入引起了FAT序列中大多数残基的剧烈的化学位移,这一实验失败了。这可能是由于在FAT蛋白中存在着两个肽结合位点(已投稿)。作为一个替换策略,Gd()-EDTA被用作顺磁探针来对结合界面进行成像。在含有20mmol/L全氘化的Tris马来酸盐、50mmol/l.NaCl、0.1mmol/ L EDTA、10O,并有不同浓度的1:1Gd()-EDTA复合物(最大浓度为9mmol/L)的缓冲液中,对0.1~0.2mmol/LN标记的FAT样品[单独或与LD2肽段混合(摩尔比1:8)]进行分析。采集其2DH-15 N HSQO谱。以在给定浓度的Gd()-EDTA下测定的NH峰高与没有顺磁表面探针存在下测定的峰高的比值来测量谱线宽度变化。从在3mmolLGd()-EDTA存在下的FAT蛋白质/ paxillin肽段复合物的标准化NH峰高中减去在同样条件下游离FAT蛋白质的标准化NH峰高。被高度保护的氨基质子位于FAT两个表面的两个疏水片段。这些结果与等温滴定热量测定数据非常一致,而且为FAT/ paxillin复合物的双结合位点模型提供了进一步的证据。然而,研究显示:镧系元素复合物倾向于与羧基紧密结合,而硝酰基倾向于与疏水表面的残基结合2,因此有可能发生顺磁探针与蛋白质的非特异性相互作用。这两种试剂的联合使用可以互补进而得到更有意义的结果
11. 我们讲述的这个实例是Ras蛋白和 Raf-CRD片段弱相互作用的例子,他们的结合在NMR时间尺度上属于快交换。但是,NMR化学位移成像技术一般用于研究结合力强的相互作用。如前文提到的,对于Kd<1mol/L的复合物,是属于NMR时间尺度的慢交换,将会观察到标记蛋白质的游离态和结合态两组不同的谱峰。因为NMR谱图一般是在01mmol/L的样品浓度下采集的,所有配体将会以亚化学计量的浓度与蛋白质结合。往往在滴定前,游离态的共振标定谱就已经知道,而结合态的并不知。对谱图的分析需要知道对代表着随配体结合而消失的游离态谱峰的特点。对结合界面谱峰的变化进行解析可能比较难,尤其是当游离态和结合态之间的化学位移变化由于谱峰重叠而难以区分时。在这种情况下,可能只能对那些位移较大的共振进行解析从而粗略地描述结合界面,或者,先获得结合态的共振标定谱,从而更精确地描绘出哪个共振因配体结合受到了扰动。
喜欢
0
赠金笔
后一篇：NDase足迹分析