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(2018-07-10 16:49:27)
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分类： PCR |
RT—PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析,还可以用来检测基因表达差异而不必构建cdna文库克隆cDNA。
RT-PCR原理
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。
RT-PCR是检测RNA模板或基因表达水平最敏感的技术之一，一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需要构建cDNA文库,即cDNA合成与PCR反应在同一BUFF即酶中进行，一步完成，省略了CDNA与PCR之间的过程。两步法RT-PCR：首先用反转录酶AMV、MULV或TthDNA聚合酶合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR。笔者对RT-PCR一步法与RT-PCR两步法进行比较，显示RT-PCR一步法：快速、简便、敏感、减少污染机会，减少了mRNA二级结构。两步法：同一管中同时扩增两个引物，减少了一些人为的误差，将RNA转录为cDNA，易于保存。两步法的费用比一步法少。
RT-PCR一步法操作流程
1．材料和方法
Access RT-PCR System 试剂盒(A1250)：Promega公司产品。
500u AMV Rev目的基因se Transcriptase, 5u/µl
500u Tfl DNA Polym目的基因ase, 5u/µl
1ml AMV/Tfl 5×Reaction Buff目的基因
1.25ml MgSO4, 25mM
100µl dNTP Mixture, 10mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP
50µl Positive Control RNA with Carri目的基因(1.25 attomole/µl)
100µl Upstream Control Prim目的基因, 15µlM
100µl Downstream Control Prim目的基因, 15µM
13ml Nuclease-Free Wat目的基因
目的基因和内参照引物
总RNA提取
具体步骤：
1) 称取各组的大鼠肺组织标本50-100mg，用剪刀将组织块剪成若干碎块(须避免RNA酶的污染)。
2) 将组织碎块加入1mlTripure中(所加组织块的体积不能超过Tripure体积的10%)，在玻璃匀浆器中充分研磨至无明显大的组织块为止，研磨过程在0℃冰水中进行，以防止组织RNA被降解。
3) 然后将组织匀浆液转移到1.5ml的Eppendorf管中，15℃-25℃的环境中孵育匀浆5min，使核蛋白复合体完全分离。
4) 加入0.2ml的氯仿，盖紧盖子，放在震荡器中剧烈震荡15秒左右，15℃-25℃的环境中孵育2min-15min。
5) 2℃-8℃冰冻离心机中离心(12000g/min，15min)。此时可见液体分层：底层——红色酚氯仿相；中间层——界面相；上层——无色液相。
6) RNA仅存于上清中。将上清转移至新管中(切勿将中间层误吸入)，
7) 加入0.5ml的异丙醇，充分混匀，室温5min-15min。
8) 2℃-8℃冰冻离心机中离心(12000g/min，10min)。
9) 弃上清(动作轻，慢)，在管底部可见一乳白色小沉淀物，即为RNA。
10) 加入1ml75%乙醇，混合震荡，（可在2℃-8℃中保存一周，－15－25℃中保存一年）
11) 2℃-8℃冰冻离心机中离心(7500g/min)5min弃上清，
12) 通风，室温中干燥5min-10min，让乙醇挥发（根据肉眼观察管内水分情况，不能太干，RNA干后难溶解）。
13) 加入30ul-50ul的0.1%的DEPC，吹打数次，
14) 55－60℃孵育10min，冰上冷却，
15) 供下一步实验使用或-70℃冻存。
RNA完整性的检测
1) 制备琼脂糖凝胶，称取琼脂糖凝胶0.34g，加入0.5×TBE缓冲液20ml，微波炉加热至熔化。
2) 最后配成终浓度为1.7%琼脂糖凝胶液体。
3) 加入溴乙啶(0.5mg/ml)2µl，混匀。
4) 冷却至室温。
5) 在水平电泳槽上制胶，凝固后浸入0.5×TBE缓冲液中，除去样本梳。
6) 取1µgRNA与1.5µl甲醛、4.5µl甲酰胺混合，
60℃水浴10min，加入1µl上样缓冲液(0.25%溴酚蓝；40%蔗糖)，75mv电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的2/3处。
RNA的纯度和浓度检测
1) 预热GeneQuant并调制好各项参数，
2) 用灭活的DEPC水1000µl调零。
3) 取RNA样品1µl，加入灭活的DEPC水1000
µl，混匀。
4) 直接读取RNA浓度和Ratio，并根据稀释情况得出实际的RNA浓度，重复操作三次取平均值。
5) RNA的Ratio均在1.7-2.0之间。RNA浓度在0.5µg/µl-1µg/µl，分装10µl一管，于-70℃冰箱中冻存。
RT-PCR
引物的配制：
1. 将所合成的目的基因和GAPDH上下游引物(1OD)用0.1%
DEPC水溶解。
2. 根据各个引物分子量的不同，计算加0.1�PC水的量。
3. 目的基因和GAPDH上下游引物所加的0.1%
DEPC水量分别为：488µl，431µl，µl，µl使其终浓度均为20pmol/µl。
4. 于-20℃冰箱中冻存，备用。
RT－PCR反应体系(25ul)：
无酶水 14.4ul
AMV Buff目的基因 5ul
dNTP 0.5ul
目的基因上游引物 0.75ul
目的基因下游引物 0.75ul
GAPDH上游引物 0.75ul
GAPDH下游引物 0.75ul
MgSO4 0.8ul
Tfl DNA Poly 0.5ul
RNA 0.8ul
将上述各成分混匀并覆盖石蜡油20 µl，标注号码后放入基因扩增仪内。
RT-PCR扩增的条件与参数：48℃，45min，94℃，2min； 94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2min共40个循环；循环完毕后68℃延伸7min。扩增产物进行电泳或-20ºC冻存。
RT-PCR产物分析：
RT-PCR产物电泳分析
1. 取6µl
RT-PCR产物与1µl上样缓冲液混合后上样于2%琼脂糖凝胶，同时以0.8µl
Ladd目的基因点样，以0.5×TBE为缓冲液电泳。
2. 75mv电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的2/3后，紫外灯下观察，扫描、拍照并进行图像分析。
3. 图像分析处理系统进行辉度扫描，并以GAPDH校正作相对量分析，数值以两者之积分吸光度的比值表示。
PCR产物测序
一步法与两步法比较
一步法RT-PCR
优点：简单，方便。
缺点：灵敏度要比两步法低。不适合PCR初期条件的摸索，出了问题之后不能够很好的找到原因。
两步法RT-PCR
优点：灵敏度要比一步法高。在初期摸索PCR条件时，可以很容易找到问题所在。还有更为关键的一点是，做两步法可以节约monney,特别是宝贵的反转录酶，把反转录体系分开做，一次的转录产物可以多次用来做PCR，非常适用于摸索PCR条件。 缺点：麻烦。
故，如果你在PCR初期建议用一步法。如果你的条件摸索成熟建议用两步法
RT-PCR原理
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。
RT-PCR是检测RNA模板或基因表达水平最敏感的技术之一，一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需要构建cDNA文库,即cDNA合成与PCR反应在同一BUFF即酶中进行，一步完成，省略了CDNA与PCR之间的过程。两步法RT-PCR：首先用反转录酶AMV、MULV或TthDNA聚合酶合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR。笔者对RT-PCR一步法与RT-PCR两步法进行比较，显示RT-PCR一步法：快速、简便、敏感、减少污染机会，减少了mRNA二级结构。两步法：同一管中同时扩增两个引物，减少了一些人为的误差，将RNA转录为cDNA，易于保存。两步法的费用比一步法少。
RT-PCR一步法操作流程
1．材料和方法
Access RT-PCR System 试剂盒(A1250)：Promega公司产品。
500u AMV Rev目的基因se Transcriptase, 5u/µl
500u Tfl DNA Polym目的基因ase, 5u/µl
1ml AMV/Tfl 5×Reaction Buff目的基因
1.25ml MgSO4, 25mM
100µl dNTP Mixture, 10mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP
50µl Positive Control RNA with Carri目的基因(1.25 attomole/µl)
100µl Upstream Control Prim目的基因, 15µlM
100µl Downstream Control Prim目的基因, 15µM
13ml Nuclease-Free Wat目的基因
目的基因和内参照引物
1.2 方法
具体步骤：
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
12)
13)
14)
15)
RNA完整性的检测
1)
2)
3)
4)
5)
6)
RNA的纯度和浓度检测
1)
2)
3)
4)
5)
RT-PCR
引物的配制：
1.
2.
3.
4.
RT－PCR反应体系(25ul)：
无酶水 14.4ul
AMV Buff目的基因 5ul
dNTP 0.5ul
目的基因上游引物 0.75ul
目的基因下游引物 0.75ul
GAPDH上游引物 0.75ul
GAPDH下游引物 0.75ul
MgSO4 0.8ul
Tfl DNA Poly 0.5ul
RNA 0.8ul
将上述各成分混匀并覆盖石蜡油20 µl，标注号码后放入基因扩增仪内。
RT-PCR扩增的条件与参数：48℃，45min，94℃，2min； 94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2min共40个循环；循环完毕后68℃延伸7min。扩增产物进行电泳或-20ºC冻存。
RT-PCR产物分析：
RT-PCR产物电泳分析
1.
2.
3.
PCR产物测序
扩增好的目的基因的PCR产物(50µl)进行测序。
一步法RT-PCR
优点：简单，方便。
缺点：灵敏度要比两步法低。不适合PCR初期条件的摸索，出了问题之后不能够很好的找到原因。
两步法RT-PCR
优点：灵敏度要比一步法高。在初期摸索PCR条件时，可以很容易找到问题所在。还有更为关键的一点是，做两步法可以节约monney,特别是宝贵的反转录酶，把反转录体系分开做，一次的转录产物可以多次用来做PCR，非常适用于摸索PCR条件。 缺点：麻烦。
故，如果你在PCR初期建议用一步法。如果你的条件摸索成熟建议用两步法
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