加载中…单克隆抗体的原理、发展历程及制备流程综述
(2018-01-29 11:42:12)
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单克隆抗体 |
分类： 抗体文章 |
通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物 ,已经成为生物制药领域的一个重要方面
,加上单细胞克隆在临床和诊断上的巨大作用
,单克隆抗体技术已经是现在生物领域研究的重要组成部分。此文就单抗隆技术的原理、发展和研究方向等进行了综述
,并对其存在的不足作了概述。
1.单克隆抗体原理
抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 B淋巴细胞能够产生抗体， 但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代， 但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。
2.单克隆抗体的发展
1975年，英国的科学家Kohler和Milstein合作将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现形成的杂交细胞既能在体外无限增殖，又能持续的分泌特异性的抗体，通过克隆化的培养可获得纯的细胞可以产生单克隆抗体。因此在1984年获得了诺贝尔医学和生理学奖。
在单克隆技术出现之后，许多研究者发现了这一技术的前景，纷纷投入到这一领域的研究。该技术也飞速的发展起来，到二十世纪八十年代中期，单克隆技术已日臻完善，开始广泛应用于生物医学研究和生物技术的各个领域，以及临床诊断和治疗的许多领域。
特别是在2000年后，人类基因组草图绘制的完成，生命科学的发展将进入后基因组时代。可以肯定的是，在未来的一段时间，人们对各种单克隆抗体的的需求会有一个很大的增长，继而，单克隆技术会有一个很大的发展。
2.1.单克隆抗体的应用
2.1.1.作为亲合层析的配体
单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。
2.1.2作为生物治疗的导向武器
质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。
2.1.3. 作为免疫抑制剂
抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。
2.1.4作为研究工作中的探针
单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。
2.1.5增强抗原的免疫原性
1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。
2.1.6作为医学检验试剂
单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：
(1)诊断各类病原体
这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。
http://s7/bmiddle/002zjnA7zy7hKyt2e0Ke6&690 (2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测
用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。
随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。
(3)检测淋巴细胞表面标志
用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。
(4)机体微量成分的测定
应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。
2.2单克隆抗体技术的研究方向
1) 新一代单克隆抗体、疫苗类药物最新进展与前景展望;
2) 新一代单克隆抗体、疫苗类药物的国际、国内市场状况;
3) 新一代单克隆抗体、疫苗类药物生产的新工艺和新技术: 包括上游表达技术、细胞培样技术、抗体嵌合技术、抗体人源化技术、下游纯化技术、单抗及疫苗类药物新的制剂方法等;
4) 新一代单克隆抗体、疫苗类药物的产业化配套技术, 检测手段, 病毒、朊病毒灭活, 工艺认证等;
5) 与单克隆抗体检测试剂有关的新技术: 如抗体的筛选、试纸的制造等;
6) 疫苗研究的最新进展。不仅如此,“单克隆抗体技术与基因克隆技术相结合更将为分离和鉴定新的蛋白质和基因开辟一条宽阔途径”。
2.3单克隆抗体存在的问题
肿瘤细胞产生一些闭性抗体，把自己保护住，使单克隆抗体所携的药物不能很好的发挥作用。
人类对单克隆抗体的技术还并不那么得心应手，仅仅是刚刚起步。
单克隆缸体的产物是从具有肿瘤细胞表型特征的细胞而来，来自这种细胞的产物是否存在生物毒害作用，特别是可能释放致癌病毒。
单克隆抗体可能诱发个体型反应，而从抗体对其靶抗原角度看，这可能造成单克隆抗体失活。反复注射单克隆抗体，可能造成对单克隆抗体的个体型免疫，并使单克隆抗体失去生物活力。
http://s9/bmiddle/002zjnA7zy7hKyyZF6o28&6903.单克隆抗体制备过程
杂交瘤细胞的制备
1)．提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。
2)．应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性
3)．对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，并进行克隆化培养，得到稳定的杂交瘤细胞，再进行大规模培养获得单克隆抗体。
单克隆抗体的提纯
一般常用金黄色葡萄球菌蛋白A－琼脂糖4B亲和层析法。
单克隆抗体的保存由腹水中获得的抗体,经离心去除细胞成分，再经冷冻超速离心,取上清液加0.1%NaN3，少量分装，冷冻于-70℃可保存几年。 但应避免反复冻融,否则抗体失活，特别是IgM抗体。提纯的单克隆抗体,冷冻干燥保存于2～8℃，取出时溶解后，保存于2～8℃，至少一个月内可保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥低温(4℃)保存两年，融化后放置4℃下保存一个月。短期使用的腹水抗体，4℃3～4 个月仍保持稳定, 培养上清加0.1%NaN3，贮于-20℃，两年不失活性。
参考文献：
[1]汪永和.杂交瘤细胞克隆化培养及其分泌的单克隆抗体的纯化[D].昆明医学院,2004.
[2]何忠效.浅谈单克隆抗体[J].生物学通报,2004,09:1-4.
[3]朱学泰,谢溱,马瑞君.单克隆抗体制备技术研究进展[J].甘肃科技,2005,03:108-109+98.
[4]孔君,刘箐,韩跃武,王天昌,刘金芝.单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J].免疫学杂志,2011,02:170-173.
[5]郭粉粉,梁文波,张学梅.单克隆抗体制备技术及应用的研究进展[J].医学综述,2011,08:1129-1131.
[6]刘萍,陈苗苗,刘学荣,牟克斌,黄银君.单克隆抗体研究进展[J].中国畜牧兽医,2012,01:67-70.
[7]孙思凡,张部昌,靳彦文.治疗性单克隆抗体研究进展[J].生物技术通讯,2009,02:258-262.
[8]张洁,张松.单克隆抗体药物的研究进展[J].中国药业,2006,14:61-62.
[9]陈光.单克隆抗体技术历史与发展简述[J].生物学通报,2003,09:58-60.
[10]孔君,刘箐,韩跃武,王天昌,刘金芝.单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J].免疫学杂志,2011,02:170-173.
1.单克隆抗体原理
抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 B淋巴细胞能够产生抗体， 但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代， 但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。
2.单克隆抗体的发展
1975年，英国的科学家Kohler和Milstein合作将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现形成的杂交细胞既能在体外无限增殖，又能持续的分泌特异性的抗体，通过克隆化的培养可获得纯的细胞可以产生单克隆抗体。因此在1984年获得了诺贝尔医学和生理学奖。
在单克隆技术出现之后，许多研究者发现了这一技术的前景，纷纷投入到这一领域的研究。该技术也飞速的发展起来，到二十世纪八十年代中期，单克隆技术已日臻完善，开始广泛应用于生物医学研究和生物技术的各个领域，以及临床诊断和治疗的许多领域。
特别是在2000年后，人类基因组草图绘制的完成，生命科学的发展将进入后基因组时代。可以肯定的是，在未来的一段时间，人们对各种单克隆抗体的的需求会有一个很大的增长，继而，单克隆技术会有一个很大的发展。
2.1.单克隆抗体的应用
2.1.1.作为亲合层析的配体
单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。
2.1.2作为生物治疗的导向武器
质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。
2.1.3. 作为免疫抑制剂
抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。
2.1.4作为研究工作中的探针
单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。
2.1.5增强抗原的免疫原性
1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。
2.1.6作为医学检验试剂
单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：
(1)诊断各类病原体
这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。
http://s7/bmiddle/002zjnA7zy7hKyt2e0Ke6&690 (2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测
用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。
随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。
(3)检测淋巴细胞表面标志
用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。
(4)机体微量成分的测定
应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。
2.2单克隆抗体技术的研究方向
1) 新一代单克隆抗体、疫苗类药物最新进展与前景展望;
2) 新一代单克隆抗体、疫苗类药物的国际、国内市场状况;
3) 新一代单克隆抗体、疫苗类药物生产的新工艺和新技术: 包括上游表达技术、细胞培样技术、抗体嵌合技术、抗体人源化技术、下游纯化技术、单抗及疫苗类药物新的制剂方法等;
4) 新一代单克隆抗体、疫苗类药物的产业化配套技术, 检测手段, 病毒、朊病毒灭活, 工艺认证等;
5) 与单克隆抗体检测试剂有关的新技术: 如抗体的筛选、试纸的制造等;
6) 疫苗研究的最新进展。不仅如此,“单克隆抗体技术与基因克隆技术相结合更将为分离和鉴定新的蛋白质和基因开辟一条宽阔途径”。
2.3单克隆抗体存在的问题
肿瘤细胞产生一些闭性抗体，把自己保护住，使单克隆抗体所携的药物不能很好的发挥作用。
人类对单克隆抗体的技术还并不那么得心应手，仅仅是刚刚起步。
单克隆缸体的产物是从具有肿瘤细胞表型特征的细胞而来，来自这种细胞的产物是否存在生物毒害作用，特别是可能释放致癌病毒。
单克隆抗体可能诱发个体型反应，而从抗体对其靶抗原角度看，这可能造成单克隆抗体失活。反复注射单克隆抗体，可能造成对单克隆抗体的个体型免疫，并使单克隆抗体失去生物活力。
http://s9/bmiddle/002zjnA7zy7hKyyZF6o28&6903.单克隆抗体制备过程
杂交瘤细胞的制备
1)．提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。
2)．应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性
3)．对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，并进行克隆化培养，得到稳定的杂交瘤细胞，再进行大规模培养获得单克隆抗体。
单克隆抗体的提纯
一般常用金黄色葡萄球菌蛋白A－琼脂糖4B亲和层析法。
单克隆抗体的保存由腹水中获得的抗体,经离心去除细胞成分，再经冷冻超速离心,取上清液加0.1%NaN3，少量分装，冷冻于-70℃可保存几年。 但应避免反复冻融,否则抗体失活，特别是IgM抗体。提纯的单克隆抗体,冷冻干燥保存于2～8℃，取出时溶解后，保存于2～8℃，至少一个月内可保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥低温(4℃)保存两年，融化后放置4℃下保存一个月。短期使用的腹水抗体，4℃3～4 个月仍保持稳定, 培养上清加0.1%NaN3，贮于-20℃，两年不失活性。
参考文献：
[1]汪永和.杂交瘤细胞克隆化培养及其分泌的单克隆抗体的纯化[D].昆明医学院,2004.
[2]何忠效.浅谈单克隆抗体[J].生物学通报,2004,09:1-4.
[3]朱学泰,谢溱,马瑞君.单克隆抗体制备技术研究进展[J].甘肃科技,2005,03:108-109+98.
[4]孔君,刘箐,韩跃武,王天昌,刘金芝.单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J].免疫学杂志,2011,02:170-173.
[5]郭粉粉,梁文波,张学梅.单克隆抗体制备技术及应用的研究进展[J].医学综述,2011,08:1129-1131.
[6]刘萍,陈苗苗,刘学荣,牟克斌,黄银君.单克隆抗体研究进展[J].中国畜牧兽医,2012,01:67-70.
[7]孙思凡,张部昌,靳彦文.治疗性单克隆抗体研究进展[J].生物技术通讯,2009,02:258-262.
[8]张洁,张松.单克隆抗体药物的研究进展[J].中国药业,2006,14:61-62.
[9]陈光.单克隆抗体技术历史与发展简述[J].生物学通报,2003,09:58-60.
[10]孔君,刘箐,韩跃武,王天昌,刘金芝.单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J].免疫学杂志,2011,02:170-173.
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