HAT筛选后的杂交瘤细胞亚克隆（也称作杂交瘤细胞克隆化）目的是确保从单个融合细胞获得所需的杂交瘤细胞系。融合后，单个孔中将出现许多不同的杂交细胞，导致每个孔中多个菌落的生长。因此，您的特定抗体分泌集落可能与其他非分泌细胞或产生不需要特异性抗体的细胞混合。
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图 1： 概述了杂交瘤细胞克隆化的各个主要阶段。

克隆技术的目的是从分离的单细胞中培养细胞的克隆，如上所述。我们用于克隆的方法是有限稀释。这意味着你将细胞稀释到一个浓度计算，以便96孔板的每个孔在电镀后将含有一个，两个或没有细胞。一旦细胞开始生长形成克隆，您可以在显微镜下观察每个孔，并且可以打折多个克隆或者根本没有克隆。
方法

• 克隆前数天解冻细胞系。

•  克隆前确保细胞快速分裂。

• 组成如下的克隆媒介：

•    含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（Lonza BE12-702F）

•    10％FBS（先前热灭活）（Genycell GCS0101-500）

•    青霉素（100U / ml）/链霉素（100mg / l）（Gibco 15950-017）

•     Ultroser G（1％）（Pall 15950-017）

•    HAT（Hypoxathine，氨基喋呤和胸腺嘧啶）补充剂，通常为50X（在500ml培养基中稀释10ml）（Gibco 21060-017）

•    1％或2％（Roche 11088947001）

• 充分混匀烧瓶中的细胞，并准确计数细胞数量。

• 将10μl细胞放入15ml离心管中的10ml克隆培养基中 - 这是用于稀释的主混合物。

• 对于每孔一个细胞/ 200ml培养基的克隆板，在16ml克隆培养基中将需要总共80个细胞，即细胞浓度为5个细胞/ ml。

• 例如：培养瓶中1ml中10×10 4个细胞的浓度等于10μl中的10×10 2个细胞或10μl中的1000个细胞。将这10ml加入到克隆培养基中意味着在克隆主混合物中将有100个细胞/ ml的浓度。将800μl该主混合物（即100个细胞）加入到另一个15.2ml克隆混合物中，将导致5个细胞/ ml的稀释度和正确的电镀稀释度。

• 将细胞充分混合，但在将其吸入微量滴定板前非常温和。

• 在96孔微量滴定板中的每个80孔中加入200μl。

• 在37℃下放置培养约5-7天。

• 在这段时间内不要搅动平板，因为这可能会使孔内的细胞移动，并且表现出没有单个克隆。

• 使用显微镜查看克隆。仔细查看每个孔的单克隆，并标记这些孔以区别于双/三元组。

• 留下克隆生长到大小的三分之一大小，然后以适当的方式进行测试（例如使用ELISA或免疫细胞化学染色技术）。

• 只测试一个克隆。

• 使用克隆培养基，将阳性克隆缓慢移入2ml孔中。不要混合不同原始微量滴定孔内容物的内容，因为这些构成潜在的不同细胞系。

• 逐渐扩大他们（不要急于他们），放入小烧瓶。

• 建议在此时重新测试上清液以确保杂交瘤细胞仍然分泌所需的抗体。

注意：杂交瘤细胞冻存如果您不确定阳性克隆是否为单克隆，则必须再次重新进行克隆，直到您确定已经获得了从单个细胞克隆的细胞系。

使用克隆方法来测试您的FCS / FBS（胎牛血清）批次的质量
当试图生产或培养杂交瘤细胞时，使用高质量的FCS / FBS是非常重要的。为了测试潜在的新一批FCS / FBS的质量，建议您使用上述方法在您目前使用的FCS / FBS中和新的血清测试批次中克隆一个杂交瘤细胞系。您会发现新批次的克隆效率与您的原始批次相似或略高。如果您没有以前的批次进行比较，您应该选择一个克隆效率至少为20％的批次，从而导致随后的健康细胞生长。