噬菌体展示技术是一种用于筛选功能性多肽的生物技术。1985年Smith首次通过基因工程的手段,将外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术。1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋白g融合展示在噬菌体表面,建立了噬菌体展示随机肽库。之后噬菌体肽库技术讯速发展,它已在许多领域如抗原表位筛选、免疫学诊断、疫苗研制、药物筛选等方面得到广泛的应用。
肽库的构建
噬菌体肽库的基本原理是将随机肽段插入到噬菌体衣壳蛋白上形成融合蛋白而展示出来,并利用噬菌体能大量复制的特点,得到不同重组噬菌体的多拷贝,为不同的研究提供有利的工具。
所谓随机性是指编码肽段的基因序列是随机的,它的来源通常是通过化学方法合成的寡聚核苷酸链的降解。有时,也可将某个基因(如抗体、病毒基因组)的全部序列随机插入到噬菌体内,组成某个基因的随机肽库,一般称为抗体库或靶基因文库。插入的肽段一般以线性形式展示在噬菌体表面,从几肽到数十肽长度不等,目前肽库已由最初的6肽、7肽发展到9肽、15肽,直到38肽、40肽。插入片段越长,为保证多样性,所需库容越大。有人曾设想构建15~100个氨基酸残基片段的肽库,以含有天然表位中的一些二级结构[6,7]。但由于噬菌体肽库的建库仍然依赖于DNA的转化,而目前最有效的电转化率也只能达到109~1010DNA;而且对于多样性高于1012的肽库,很难从中富集到所需的噬菌体重组肽段;再次,噬菌体中插入的基因经噬菌体表达后,往往以线性肽展示在菌体外壳蛋白上,这种肽段结构的单一性限制了它的应用。
随着噬菌体展示技术应用范围的拓宽,外源基因表达的载体从M13噬菌体拓展到了噬菌体、酵母和细菌,所插入的外源基因片段也从小肽基因扩展到了抗体片段基因、蛋白质基因和cDNA文库等。
肽库的筛选
如何从噬菌体肽库中筛选到特异的重组噬菌体是肽库技术的关键。目前普遍采用一种称之为生物淘洗的方法。根据靶分子(抗体或受体)所处的状态不同,可将筛选方法分为固相筛选和液相筛选。固相筛选与标准的酶联免疫检测法(ELISA)类似,直接将靶分子包被ELISA板、ELISA管上或与琼脂交联。液相筛选是将靶分子和生物素相联,噬菌体与溶液中的已生物素化的靶分子相互作用后,加入到包被了亲和素的塑料管或平皿中,洗涤去掉未结合的噬菌体,其余的操作流程两者都一样:包被靶分子,封闭非特异性位点,加入噬菌体肽库共温育,洗掉没有结合的噬菌体,继之以竞争性受体或酸洗脱吸附的专一性结合的噬菌体,感染对数期的宿主菌,经繁殖扩增后,进行下一轮的筛选。经过3~5轮的吸附洗脱扩增#后,递呈特异多肽的噬菌体得到了高度富集,最终可以获得具有特异结合性质的多肽/蛋白质,并实现基因克隆化。筛选过程中,关键是第一轮的筛选要得到较多的克隆,这样才能保证后几轮的筛选中所投入的噬菌体含有较多种类的肽序列。故经常通过加入高浓度的靶分子、延长靶分子与噬菌体作用时间和减少洗脱次数来使第1轮得到较高的噬菌体滴度。第2、3轮的筛选目的主要是富集高亲和力的克隆,故可通过降低靶分子与投入噬菌体浓度的比例、提高洗脱强度和采用竞争洗脱来达到此目的,如有必要可进行第4轮的筛选。
生物筛选技术最明显的优势表现在体外(细菌外)就可以获得目的分子的DNA序列,进行外源多肽的研究。
噬菌体肽库的应用
抗原表位研究 传统的抗原表位分析主要是通过分析抗原经物理化学降解得到的片段或人工合成一系列来源于抗原的肽段与相关抗体的结合活性而得到,此方法成本高,必须首先确定蛋白质的氨基酸序列,才能合成相应的肽,而在实际研究中,许多蛋白质的序列并不清楚。此外,由于表位多数情况下为包含结合受体所必需的某些氨基酸不连续的空间构象,仅少数为一段连续的线性氨基酸残基,因此线性的合成肽仅能模拟蛋白质的线性表位,无疑会丢失众多的构象型表位信息。
噬菌体肽库技术将抗体作为受体暴露于肽库中,筛选到能与特异性抗体相结合的重组噬菌体肽的序列,弥补了合成肽筛选的不足。在抗原-抗体的识别研究中,不必源于天然抗原,可以从随机肽库中直接筛选出能和抗体结合的表位,这些表位既可是线性表位,也可是模拟的构象型表位,且不必预先确定蛋白质的氨基酸序列。尽管有时与天然表位在氨基酸顺序上可能不一致,但是它能模拟天然配体的结合特性,免疫动物后,可以诱导出与天然表位起交叉反应的抗体,竞争和抑制试验均表明能起到天然表位的作用。
1984年建立的第1个肽库就是用来分析未知的抗原表位的。迄今为止已将数百个抗体的表位阐明,如P内啡肽、白介素1碱性成纤维生长因子、乙酞胆碱受体抗体等。该技术在肿瘤相关抗原表位的研究中也有重要作用。肿瘤相关抗原与正常细胞的抗原分子十分相似,应用单克隆抗体技术可区别两者之间的细微差异。体现这种差异的分子及其机制是目前肿瘤研究的热点,目前研究正由天然蛋白大分子向亚单位、表位多肽过渡,用噬菌体随机肽库可获得一些可与单克隆抗体结合的噬菌体呈现肽,为进一步研究噬菌体呈现肽与细胞表达的天然肿瘤抗原之间的关系奠定了基础。
免疫诊断研究 感染性疾病患者血清中含有针对抗原的各种抗体,但只有在天然抗原是微生物或者是已被克隆表达的情况下才容易获得纯抗原来鉴定特异性的抗体。而噬菌体随机肽库技术可以在某些天然抗原未知或天然抗原不容易获得的情况下,将特异性的重组噬菌体多肽作为抗原模拟肽用于临床疾病的免疫诊断。
Motti用2株抗人乙肝表面抗原的单抗筛选15肽库,获得的多肽不仅可以与抗人乙肝表面抗原单抗结合,而且可被乙肝患者的血清抗体识别。在天然抗原的序列中找到了与其相似的多肽序列,进一步表明所筛到的抗原型表位可作为临床诊断试剂。钱旻等用日本血吸虫虫卵单克隆抗体6B12作诱饵#,筛选到13株与6B12有特异性、高亲和力反应的噬菌体克隆,序列分析这13株噬菌体所携带的外源多肽,其序列完全相同,而且能与血吸虫病患者血清IgG抗体特异性结合,有望替代天然抗原用于血吸虫病诊断。
然而,在很多情况下,人们并不知道疾病的致病原,而且也很难得到病原体特异的单克隆抗体,如在过敏性、传染性或自身免疫性疾病的研究中,存在着对有关致病基因和抗原的认识不足或获得困难等问题。因此可利用患者血清中所含特异性多克隆抗体来筛选噬菌体随机肽库,获得相应抗原表位,有可能进一步找到特异的诊断试剂。
1999年杜勇等以纯化的丙型肝炎病毒(HCV)多克隆抗体作为筛选分子,生物淘洗噬菌体递呈的随机7肽库。将筛选的噬菌体克隆进行ELISA检测、DNA测序以及竞争抑制试验
等,最后分析7肽氨基酸序列表明,HCV核心蛋白存在着至少3个B细胞抗原位点,其中19~25aa间(PQDVKFP)的线性表位是该蛋白的优势表位。2000年杜勇等用HIV病人血清的IgG抗体淘洗噬菌体递呈随机12肽库,再以正常人IgG抗体吸附,筛选到了能与HIV病人血清发生特异反应的噬菌体克隆,经ELISA、DNA测序等,成功筛选出了位于HIVgp41外膜蛋白、高亲和力、构型特异的优势B细胞抗原表位(602GCSGKLICTTNV613)。用大肠埃希杆菌硫氧还蛋白作为骨架,在其活性部位以内融合#形式重组表达了该抗原表位,纯化的重组蛋白具有良好的抗原性,能与HIV( )IgG抗体及艾滋病人血清呈特异反应。
基因疫苗研究 运用肽库的最大优点是不需要靶蛋白的任何结构,只需利用其抗体或受体来捕获噬菌体肽库中的小配体,并可大量繁殖,这为疫苗的设计、生产提供了极大方便。实验证明[29],丝状噬菌体在多种动物系统中都具有良好的免疫原性,可作为载体与抗原模拟肽合成完全抗原,引起小鼠类似于天然抗原引起的免疫应答,产生的抗体能与天然抗原反应,通过检测免疫小鼠产生的抗体水平,从而筛选并确定噬菌体多肽作为疫苗。
人类免疫缺陷病毒(HIV1)的gp120超变区V3环区可识别抗体分子,单独的V3片段免疫小鼠诱导产生的免疫反应仅局限于免疫的片段序列,而用肽库筛到的重组V3肽段免疫小鼠,不仅可诱发上述的免疫反应,还可激活T细胞分泌细胞因子,诱导更广泛的免疫反应。Pereboeva等利用亲和层析法纯化HCV患者阳性血清中的多克隆抗体,从噬菌体随机肽库中筛选到丙型肝炎病毒核心蛋白、NS3及NS4蛋白的多个抗原表位,同时也证实了这些噬菌体短肽具有用作疫苗的潜在价值。Dybwad等也通过实验证实了这一技术的有效性。
周东明等以纯化的旋毛虫感染鼠血清IgG为配基,筛选到能与旋毛虫感染鼠血清IgG特异性反应的21个克隆,混合免疫小鼠后减虫率与减卵率分别为42.8%、66.3%,显示出这些短肽分子能诱导明显的抗旋毛虫的保护性免疫。
药物筛选和开发研究 传统的新药开发,由于对蛋白质结构与功能关系不够了解,只能通过大规模的定点突变和费时的单个目的蛋白的克隆表达纯化与筛选来修饰现有蛋白。而噬菌体展示肽技术只要以一定功能的靶分子为受体,在天然蛋白质或特定功能的框架分子噬菌体展示文库中筛选配体,就可以简便快速地获得与靶分子具有强亲和力和特异性的小肽或新型蛋白,作为候选药物开发。目前该技术已广泛用于癌症、艾滋病、心血管病、组织器官移植、神经性疾病等领域药物的研究和开发,并已筛选出大量的受体拮抗物、酶抑制剂等。
随机噬菌体展示肽库能展示出适当构型的小肽模拟天然蛋白的功能,如多肽激素EPO和TPO的模拟多肽对人类疾病有很好的治疗作用,14个氨基酸的环形TPO模拟多肽二聚体与332个氨基酸的TPO具有同样的生物功能,而仅13个氨基酸构成的模拟配基可模拟162个氨基酸组成的EPO的性质。