加载中…国家标准 GB/T 4789.35-2008 乳酸菌检测
(2011-08-18 09:25:33)
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国家标准gb/t4789.35-2008乳酸菌检测教育 |
引用标准：GB/T 4789.35-2008
1检测目标：乳酸菌。
2主要仪器设备
2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.2 恒温培养箱： 28 ℃±1 ℃。
2.3 均质器。
2.4 恒温振荡器。
2.5 显微镜：10×～100×。
2.6 电子天平：感量0.1 g。
2.7 无菌锥形瓶:容量500 mL、250 mL。
2.8 无菌广口瓶：500 mL。
2.9 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)。
2.10 无菌平皿：直径90 mm。
2.11 无菌试管: 10 mm×75 mm。
2.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。
2.13 高压灭菌锅。
2.14 超净工作台。
2.15 水浴锅。
3 培养基和试剂
3.1 MRS培养基及莫匹罗星锂盐改良MRS培养：
3.1.1 成分
蛋白胨 10.0 g
牛肉粉 5.0 g
酵母粉 4.0 g
葡萄糖 20.0 g
吐温80 1.0 mL
K2HPO4·7H2O 2.0 g
醋酸钠·3H2O 5.0 g
柠檬酸三铵 2.0 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
MnSO4·4H2O 0.05 g
琼脂粉15.0 g
pH 6.2
3.1.2 制法
将上述成分加入到1000 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。
3.2 MC 培养基：
3.2.1 成分
大豆蛋白胨 5.0 g
牛肉粉 3.0 g
酵母粉 3.0 g
葡萄糖 20.0 g
乳糖 20.0 g
pH6.0
琼脂 15.0 g
蒸馏水 1 000 mL
1％中性红溶液5.0 mL
碳酸钙 10.0 g
3.2.2 制法
将前面7 种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节pH，加入中性红溶液。分装后121 ℃高压灭菌15min～20 min。
3.3 乳酸杆菌糖发酵管
3.3.1 基础成分
牛肉膏 5.0 g
蛋白胨 5.0 g
酵母浸膏 5.0 g
吐温80 0.5 mL
琼脂 1.5 g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL
蒸馏水 1 000 mL
3.3.2 制法
按0.5%加入所需糖类，并分装小试管,121 ℃高压灭菌15 min～20 min。
3.4 七叶苷发酵管。
3.4.1 成分
蛋白胨 5.0 g
磷酸氢二钾 1.0 g
七叶苷 3.0 g
柠檬酸铁 0.5 g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL
蒸馏水 100 mL
3.4.2 制法
将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解，121 ℃高压灭菌15 min～20 min。
3.5 革兰氏染色液
3.5.1 结晶紫染色液
3.5.1.1 成分
结晶紫 1.0 g
95％乙醇 20 mL
1％草酸铵水溶液 80 mL
3.5.1.2 制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
3.5.2 革兰氏碘液
3.5.2.1 成分
碘 1.0 g
碘化钾 2.0 g
蒸馏水 300 mL
3.5.2.2 制法
mL。
3.5.3 沙黄复染液
3.2.1 成分
沙黄 0.25 g
95％乙醇 10 mL
蒸馏水 90 mL
3.5.3.2 制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
3.5.4 染色法
3.5.4.1 将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗。
3.5.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。
3.5.4.3 滴加95 ％乙醇脱色，约15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。
3.5.4.4 滴加复染液，复染1 min。水洗、待干、镜检。
4 操作步骤
4.1 样品制备
4.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
4.1.2 冷冻样品可先使其在2 ℃～5 ℃条件下解冻，时间不超过18 h，也可在温度不超过45 ℃的条件解冻，时间不超过15 min。
5.1.3 固体和半固体食品：以无菌操作称取25 g 样品，置于装有225 mL 生理盐水的无菌均质杯内，于8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，制成1:10 样品匀液；或置于225 mL 生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min 制成1:10 的样品匀液。
5.1.4 液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25 mL 放入装有225 mL 生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。
5.2 步骤
5.2.1 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL 生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
5.2.2 另取1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10 倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1 次1 mL 灭菌吸管或吸头。
5.2.3 乳酸菌计数
5.2.3.1 乳酸菌总数
根据待检样品活菌总数的估计，选择2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL 样品匀液分别置于2 个MRS琼脂平板，使用L 形棒进行表面涂布。36℃±1℃，厌氧培养48 h±2 h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min 内完成。
5.2.3.2 双歧杆菌计数根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL样品匀液于莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS 琼脂
平板，使用灭菌L 形棒进行表面涂布，每个稀释度作两个平板。36℃±1℃，厌氧培养48 h
±2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15 min 内完成。
5.2.3.3 嗜热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL样品匀液分别置于2 个MC 琼脂平板，使用L 形棒进行表面涂布。36℃±1℃，需氧培养48 h±2 h后计数。嗜热链球菌在MC 琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2 mm±1mm，菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在15 min 内完成。
5.2.3.4 乳杆菌计数
5.2.3.1 项乳酸菌总数结果减去5.2.3.2 项双歧杆菌与5.2.3.3 项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。
5.3 菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
5.3.1 选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
5.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
5.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
5.1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置
于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
5.2 培养
待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。
5.3 菌落计数
肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colonyforming units，CFU）表示。
选取菌落数在10 CFU～150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。
5.4 结果的表述
5.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平
均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。
5.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：
…………………………………………(1)
公式中：
N——样品中菌落数；
ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
5.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
5.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5.4.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。
5.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5.5 菌落数的报告
5.5.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
5.5.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
5.5.3 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。
6 结果与报告
根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g（mL）表示。
7 乳酸菌的鉴定（可选做）
7.1 纯培养
挑取3 个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于MC 琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS 琼脂平板，置36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h。
7.2 鉴定
7.2.1 双歧杆菌的鉴定按GB/T 4789.34 的规定操作。
7.2.2 涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏染色阳性。
嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5 μm～2.0 μm，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。
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