生物实验-Pull Down技术
(2014-07-29 16:59:58)
Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。Pull-Down实验是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知蛋白的表达和相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。Pull-Down实验至少需要一种纯化的标签蛋白（诱饵）用来捕获和“pull-down”靶蛋白（猎物）。
Pull-Down
vs.免疫沉淀
Pull-Down实验是亲和纯化的一种形式，其与免疫沉淀十分类似，不同之处在于使用诱饵蛋白代替了抗体。在Pull-Down实验中，带有标签的诱饵蛋白被特异结合该标签的固相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。含有固相化诱饵蛋白的次级亲和支持物可以与含有推测猎物蛋白的各种蛋白样品相互孵育。如果缓冲液及样品条件与靶结合相互作用兼容，且诱饵蛋白在带有标签和被固相化时仍然可以行使功能，那么存在于样品中的猎物蛋白就会结合到亲和支持物上。如果特异结合相互作用的亲和性足够强，那么非结合的样品成分可以被洗涤掉，进而纯化形式的猎物或诱饵-猎物复合体可被从支持物上洗脱下来。
诱饵蛋白固相化策略
依赖固相化抗体结合蛋白（例如蛋白A或蛋白G琼脂糖）的免疫沉淀形式显然对pull-down实验不是很有效。必须使用其他亲和系统固相化诱饵蛋白（例如‘bait
the
hook’）。如果有纯化的天然的诱饵蛋白，可将其用生物素进行标记或偶联一些其他小的标签，以适用于现成的亲和树脂。即用型生物素化试剂及标记试剂盒（见目录第九节，281页），可实现使用链亲和素琼脂糖树脂进行pull-down实验。
如果被用作诱饵的蛋白是重组蛋白，那么其很可能会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标签就会成为该诱饵蛋白用于pull-down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His），其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体。接下来的试剂盒被优化用于这些特别的亲和系统。列于下面几页中的Thermo
Scientific GTPase
Pull-Down和检测试剂盒，使用含有GST标签的特异GTPase蛋白的下游效应子进行检测。
不同Pull-Down系统的优点及缺点
用于免疫沉淀或pull-down实验的每个亲和系统均有其不同的特性，在应用中会带来不同的挑战和优势。例如，如果二价金属在靶蛋白相互作用中是基本的辅因子，那么固相化金属螯合亲和色谱（immobilized
metal-chelate affinity
chromatography,IMAC）系统可能不会成为一个兼容平台。有效的pull-down实验，需要找到特定的结合、洗涤和洗脱条件，来实现目标蛋白相互作用的特异性及兼容性。
c-Myc和HA-标签蛋白
与GST和His标签不同，c-Myc和HA-肽段标签在用于重组表达系统时需要标签特异性抗体进行亲和纯化。在这些情况下，研究含有c-Myc或HA-标签诱饵蛋白的蛋白质相互作用时也包含进行免疫共沉淀。因为这些标签非常常见，所以IP/co-IP试剂盒提供即用型亲和树脂（例如抗标签抗体共价固相化至珠状琼脂糖微珠）。
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