小孢子培养技术

a.小孢子培养步骤

（1）选蕾 ：一般选择在天气晴朗的正午8：00-10：00之间取材，尽量选取主花序或生  长状态较好的花序，然后在实验室选取大小在2.5~3.5mm之间的花蕾备用。
注释：
①、 如果遇到阴雨天气，为了不影响实验进程也可以取材，但一定要选取生长良好的花序，因为有研究报道低温有利于小孢子的胚胎发生。
②、甘蓝型油菜花序一般选取大小在2.5~3.5mm之间的花蕾，但是不同的油菜品种花蕾的发育时期不尽相同，可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定恰当发育时期（最佳时期为单核晚期至二核期）。
③、取蕾以后如果不能立刻进行小孢子的提取过程的话，应将花蕾放置于湿润的条件下低温保存。
（2）消毒：选取的花蕾用75%的酒精消毒1min（一般不要超过一分钟），然后用升汞消毒8-10min, 最后用无菌水清洗3次，每次5 min。
（3）抽提花粉：
①、将花蕾放置于玻璃管中，加入1-2滴B5液体培养液，用玻璃棒研磨使花粉散出，倒入过滤器过滤，花粉滤液盛入10ml离心管
②、用滴管吸B5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉，冲2-3次后，在10ml离心管中将花粉悬浮液稀释
③、将花粉悬浮液离心，800转/min，离心5min
④、将离心管中的上层清液吸去，再加液体B5抽提液，并将沉淀的花粉用吸管冲散，再次悬浮离心（用封口膜封口），800转/min，离心5min，吸去上层清液
（4）加倍培养：
①、将沉淀的花粉用NLN-16 液体培养基稀释（注：稀释不要超过10ml, 因为加倍完以后还要在10ml的离心管中再次稀释离心），倒入三角瓶在32℃条件下暗培养2天左右（48h -72h之间）。
②、然后检查是否有污染的现象，如果没有污染，则分皿继续培养。
（5）胚诱导培养：
①、将加倍后没有污染的NLN-16花粉悬浮液再次倒入离心管中离心，600转/min，离心5min，倒掉NLN-16液体，留下沉淀的花粉。
②、将沉淀的花粉再次用NLN-13培养液稀释，稀释后的悬浮液分装入7.5cm培养皿，一般每皿加入悬浮液3ml\左右，每ml含花蕾大约1.5-2个，用封口膜封口。
③、将封口的培养皿在25℃的条件下进行暗培养，大概10天左右开始查看是否有可见的颗粒状胚的形成，如果没有则继续培养，如果有可见的胚出现，则移至50rpm、25℃恒温摇床上继续进行暗培养。
④、当暗培养的胚发育至子叶形胚形成时移入B5固体培养基，于20℃，16 hr光/8 hr暗，2000LUX光强条件下培养。
b.再生苗的诱导与培养阶段
（1）将暗培养获得子叶形胚移入B5固体培养基，于20℃，16 hr光/8 hr暗，2000LUX光强条件下培养，进行再生苗的诱导。
（2）进行再生苗诱导培养的胚一般15天左右换一次培养基进行继代培养，具体的时间依据胚在培养基的中生长状态决定，继代1-2次直至长出再生植株。
（3）长出的再生植株继续在B5固体培养基上培养，依据生长状态定期进行继代
c.移栽阶段
   获得的再生苗一般在10月中旬开始移栽到大田，移栽时先要洗尽根部的培养基，移栽后立刻浇足定根水，用遮阳网覆盖，一般白天覆盖，晚上打开，直至移栽的再生苗成活，然后按照一般的大田管理进行管理。

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