动物细胞培养技术能否大规模工业化、商业化，关键在于能否设计出合适的生物反应器（bioreactor）。由于动物细胞与微生物细胞有很大差异，传统的微生物反应器显然不适用于动物细胞的大规模培养。首先必须满足在低剪切力及良好的混合状态下，能够提供充足的氧以供细胞生长及细胞进行产物的合成。

一、生物反应器分类

目前，动物细胞培养用生物反应器主要包括：转瓶培养器、塑料袋增殖器、填充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤维及其它膜式反应器、搅拌反应器、气升式反应器等。

按其培养细胞的方式不同，这些反应可分为以下三类：

1、悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、气升式反应器；

2、贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器；

3、包埋培养用反应器：如流化床反应器、固化床反应器。

二、搅拌罐生长反应器 这是最经典、最早被采用的一种生物反应器。此类反应器与传统的微生物生物反应器类似，真对动物细胞培养的特点，采用了不同的搅拌器及通气方式。通过搅拌器的作用使细胞和养分在培养液中均匀分布，使养分充分被细胞利用，并增大气液接触面，有利于氧的传递。现已开发的有：笼式通气搅拌器、双层笼式通气搅拌器、桨式搅拌器、海般式搅拌器等。

三、气升式生物反应器

1979年首次应用气升式生物反应器成功的进行了动物细胞的悬浮培养。气升式生物反应器的话优点：

罐内液体流动温和均匀，产生剪切力小，对细胞损伤较小；

可直接喷射空气供氧，因而氧传递率较高；

液体循环量大，细胞和养分都能均匀分布于培养液中；

结构简单，利于密封并降低了造价。

常用的气升式反应器有三种：内循环式气升式、外循环式气升式、内外循环式气升式生物反应器。

四、鼓泡式生物反应器

与气升式反应器相类似，是利用气体鼓泡来进行供氧及混合，其设计原理与气升式生物反应器也相同。

五、中空纤维生物反应器 用途较广，既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。其原理是：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用反应器内数千根中空纤维的纵向布置，提供细胞近似生理条件的体外生长微环境，使细胞不断生长。中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，富含毛细管，培养时纤维管内灌流充以氧气的无血清培养液，管外壁则供细胞黏附生长，营养物质通过半透膜从管内渗透出来供细胞生长；对于血清等大分子营养物，划必须从管外灌入，否则会被半透膜阻隔不能被细胞利用；细胞的代谢废物也可通过半透膜渗入管内，避免了过量代谢物对细胞的毒害作用。

优点是：

占地空间少；

细胞产量高，细胞密度可达10⁹数量级；

生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞。

六、生物反应器的设计和放大 设计的总体考虑是：

①结构严密，能耐受蒸汽灭菌，采用对生物催化剂无害和耐蚀材料制作，内壁光滑无死角，内部附件尽量减少，以维持纯种培养需要；

②有良好的气-液接触和液-固混和性能和热量交换性能，使质量与热量传递有效地进行；

③保证产物质量和产量前提下，尽量节省能源消耗；

④减少泡沫产生，或附有消沫装置以提高装料系数，并有必要可靠的参数检测和控制仪表并能与计算机联机。

生物反应器的放大一种新的生物技术产品从实验室到工业生产的开发过程中，会遇到生物反应器的逐级放大问题，每一级约放大10～100倍。生物反应器的放大，表面看来仅是一个体积或尺度放大问题，实际上并不是那么简单。

反应器放大研究虽已提出了不少方法，但还没有一种是普遍都能适用的。目前还只能是半理论半经验的，即抓住反应过程中的少量关键性参数或现象进行放大。

有关氧传递问题在生物反应器中，氧的传递速率要满足细胞对氧的摄取速率，并使反应器中溶解氧的浓度CL要维持在一定水平上。这就是说，在稳态情况下，供氧与需氧间存在下列关系：KLa(C*-CL)=r

此处， KLa为氧的传递系数；C*为相当气相氧分压的溶氧浓度，CL为培养液中溶氧浓度，r为摄氧率。

影响供氧的因素从上式可知r=KLa(C*-CL)；因此影响供氧的因素总体上讲是KLa和C*-CL值。

要增大C*-CL，无非是增大C*值或降低CL值。增大C*的措施，有适当增加反应器中操作压力和增大气相中的氧分压两个方法。在实际操作中，反应器保持一定正压，以防止大气中的杂菌从轴封、阀门等处侵入，但在增加罐压的同时，发酵代谢所产生的CO₂也会更多地溶解于培养液而对发酵不利。至于CL值，一般不允许过分减小，因为细胞在生长中有一个临界氧浓度，低于此临界值，细胞的呼吸将受到抑制。

影响KLa的因素大致可分为三个方面：一是反应器的结构，包括相对几何尺寸的比例；二是操作条件，如搅拌功率或循环泵功率的输入量，通气量等；三是培养或发酵液的物理化学性质，如流变特性，特别是其粘度或显示粘度、表面张力、扩散系数、细胞形态、泡沫程度等。

生物反应器中的传热在细胞培养和发酵过程中，热量的释放是普遍存在的。这是因为在培养或发酵过程中细胞与周围环境的物质产生新陈代谢，即发生异化（分解）作用和同化（合成）作用，而异化作用一般释放能量，同化作用则是吸收能量。同化作用包括细胞生长、繁殖、产物形成所需能量来自细胞对培养基中的基质及营养成分的异化。从热力学角度讲，异化所产生能量必然应多于同化所需要能量，而多余的能量则转化为热能释放到周围环境中去。无论是涉及细胞或酶的反应中，释放出的热量都应及时移去，以免影响过程的正常进行，为此在生物反应器中一般都附有冷却装置。

微载体培养技术（microcarrier culture technique）

一、微载体培养应用 此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。经过三十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。

使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT?B反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。

二、微载体 是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。

微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。

微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm²，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。

微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。

三、微载体培养原理与操作

1、原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。

贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。

2、搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。

3、细胞与微载体的相融性，是与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理PH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。

4、细胞在微载体表面的生长 影响细胞在微载体表面生长的因素很多，主要有三个方面。

在细胞方面，如细胞群体、状态和类型。

在微载体方面，如微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。

在培养环境中，如培养基组成、温度、pH、DC以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。

5、微载体培养操作要点

培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的PH与温度水平，接种细胞（对数生长期，而非稳定期）至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。

贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。

培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随意细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液：停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37℃），重新开始搅拌。

收获细胞：首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min。然后解离收集细胞及其产品。

微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L以上。 四、微载体大规模细胞培养的生物反应器系统 此技术大规模培养，细胞扩增的效率受到诸多因素的影响和限制，其中主要的限制性因素包括：细胞对剪切力的敏感性、氧的传递以及传代和扩大培养等。而研制的各种类型生物反应器系统则可针对上述限制性因素，为微载体细胞培养与扩增提供低剪切力、高氧传递效率、易于细胞传代等适宜的外部环境。已较多使用的微载体培养系统生物反应器，可以实行计算机控制操作，培养搅拌速度及悬浮均匀程度、温度变化、PH稳定及溶氧供应（O₂ 、N₂ 、CO₂、空气四种纯化气体按比例调节）、罐压、培养体积和通气量等参数全部由电脑自动控制。因此，应用生物反应器系统进行微载体细胞大规模扩增具有明显优势，目前国外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统，如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统以及灌注式生物反应器系统等。

1、搅拌式生物反应器系统 搅拌式生物反应器系统在微载体细胞大规模扩增研究领域已有较长的研究历史，但因该细胞培养系统容易产生过大的剪切力，从而限制了其应用范围。尽管如此，由于该系统具有简单、实用及价格低廉等特点，国内外仍有不少应用该系统成功进行细胞大规模扩增的研究报道。例如，Werner A（2000年）成功地在该系统内进行了肝细胞大规模扩增的研究。

2、灌注式生物反应器系统 灌流培养是目前研究热点之一。它的特点是不断地加入新鲜培养基以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗培养基，使细胞得以在一个相对稳定的生长环境内增殖，即省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，且可以提高细胞密度10倍以上。

3、旋转生物反应器 近年来，旋转生物反应器系统（RCCS）已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统。该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器。RCCS既可以用于微载体大规模细胞培养，又能在其内培育细胞与支架形成的三维空间复合体。至今，近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。

五、微载体培养优点

表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高；

把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；

可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；

简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；

培养基利用率较高；

放大容易；

细胞收获过程不复杂；

劳动强度小；

培养系统占地面积和空间小。