利用酵母双杂交技术分离调控基因的相互作用蛋白

 

摘要： 1 实验原理酵母双杂合系统是在1989年由Stanley Fields和Ok-kyu Song等提出并初步建立的，该系统是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中研究蛋白质间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法。近几年来随着人们 1  实验原理

 

酵母双杂合系统是在1989年由Stanley Fields和Ok-kyu Song等提出并初步建立的，该系统是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中研究蛋白质间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法。近几年来随着人们对该系统的广泛应用，这一系统得到了不断的完善及改进。这一技术在不同研究领域中的广泛应用有力地推动了蛋白质与DNA、蛋白质与RNA、以及多种蛋白质分子间相互作用的研究。

 

酵母双杂交系统的原理如图1所示。典型的真核生长转录因子如GAL4、GCN等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain，BD)和转录激活结构域(transcription-activating domain，AD)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且不同的两个结构域可以重建，发挥转录激活作用。激活作用可以通过报道基因的表达来探测蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

 

在酵母双杂交系统中，主要包含两类载体，即含DNA 结合结构域（BD）的载体和含DNA激活结构域（AD）的载体。这两类载体在构建融合基因时，待测蛋白基因及诱饵蛋白基因必须分别与两个结构域的基因在阅读框内融合。融合基因在酵母细胞报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-BD载体具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-AD载体没有。因此，在GAL4-AD氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用BD结构域基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-BD编码序列。常用的AD结构域基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。

 

酵母双杂交系统的另一个重要组成部分是报告株。报告株是指经改造的、含报告基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，它具有许多优点: 〈1〉 易于转化，便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-BD， LexA-BD)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-AD， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白质之间的作用使得转录因子重建导致相邻的报告基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白质之间的相互作用。

 

2 试剂与设备

2.1. 用品和仪器：

 

10cm平板，15cm平板，涂布棒，高速离心机，接种环 摇床，恒温培养箱，试管，水浴锅，15mL 离心管，100mL 离心管，无菌工作台

 

 

1）YAPD培养基（配法见表26.1）

2）SD培养基  （配法见表26.1）

3）LB培养基  （配方见表26.1）

3) 1× TE/LiAc：1mL  10℃TE  1mL  10×LiAc  8mL 双蒸水

4) 1× TE/LiAc/PEG: 1mL  10×TE  1mL  10×LiAc   8mL  50% PEG

5) 50% PEG:取5mL  PEG加入等体积的无菌水，加热至50℃使其充分互溶；

6）10×TE Buffer：0.1M Tris-HCL,10Mm EDTA ,pH= 7.5

7) Z Buffer:Na2HPO4.7H2O=16.1g/L;aH2PO4.H2O=5.50g/L;KCL=0.75g/L;

MgSO4.7H2O=0.246g/L，pH=7.0

8）X—gal显色液：1mL  Z Buffer,2.7μl β-巯基乙醇

9）酵母裂解液I：100 Mm Trizma, 20 μM β-巯基乙醇,pH=9.3

10) 酵母裂解液II: 1 M山梨醇，1M醋酸，1%纤维素酶，20 μM β-巯基乙醇,pH=5.5

11）细菌裂解液I：溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl（pH=8.0），10mmol/L EDTA）

12）细菌裂解液II: 0.2mol/L NaOH，1% SDS

13) 细菌裂解液III: 147.2g KAc，57.5mL 冰醋酸，加水至500mL

14) 其它：，3-AT，氨基酸，AH109酵母，鱼鲑精DNA,100%DMSO

 

3  实验方法

3.1诱饵蛋白的PCR扩增及克隆

以cDNA文库为模板对诱饵蛋白基因的开放阅读框序列进行PCR扩增，在0.2ml PCR反应管中依次加入超纯水

16.2μl、10×buffer2.5μl、dNTP2.5μl、Primer 1 和Primer 2 引物各1.3μl、模板1μl、高保真DNA聚合酶0.2μl，总体积25μl。混匀器上混匀，4℃瞬时离心，在PCR仪上进行反应，设置反应条件为: 94℃ 4 min一个循环，(94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min) 30个循环，72℃8 min一个循环，反应结束后，取5μl上样于1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

 

将含有目的片断的PCR产物收集起来进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察目的片断分离即可切胶。参见上海生工凝胶回收试剂盒说明，将切割下的含目的片段的凝胶称重，于l.5ml离心管中每100微克加300ul的banding buffer，在50℃以上加热溶解，每隔两分钟在混匀器上混匀一次，10min以后将溶解DNA的banding buffer转入纯化柱子于4℃，8000 rmp离心1min:加入500ul的washing solution,室温放置2 min于4℃，8000 rmp离心1min，重复washing solution步骤一次。然后将纯化柱子再离心一次（4℃，8000rmp离心1min）。加超纯水30μl于纯化柱子中，室温放置2 min，然后将纯化柱子放在一个干净的l.5ml离心管中，于4℃，12000 rmp离心1min，所得产物-20℃保存。

 

应用连接酶将纯化后的PCR产物与pMD18-T 载体进行连接，连接试剂为pMD18-T 载体1μl，纯化的DNA片段4μl，连接酶5μl，连接条件是在16℃连接过夜。

 

取连接反应产物10μl，加入DH5α感受态宿主菌80μl，轻轻混匀后冰浴0.5h; 42℃热休克60s~90s，冰上放置5min，加入1000μl LB培养液，37℃轻轻振摇l h，3000r/min离心2min，弃上清液留200μl沉淀菌混匀后，均匀涂布于含Amp的LB平板上进行筛选，37℃培养过夜。 

 

挑选形态较好数个菌落，接种于5ml LB培养基中(含Amp 100ng/μl)，37℃摇床200转/min震荡培养过夜，随机挑选7个克隆，经PCR初步鉴定后，碱裂解法提取质粒，EcoRI酶切鉴定，对鉴定正确的克隆，重新摇菌、提质粒，由上海英俊公司进行测序。

 

质粒提取过程如下：细菌培养：从琼脂平板上挑取单菌落接入5ml含适合抗生素的LB培养基中，于37℃摇床中振荡培养过夜。第二天早晨保种：取80%灭菌甘油300ul加入1ml菌种中冷冻保存。然后提取质粒 ：

 

（1）1.5ml过夜培养物倒入EP管，5000rpm/10min，弃上清；

（2）加入150μl冰预冷的solutionⅠ，混悬器上混匀，使菌分散重悬；

（3）加入300μl solutionⅡ，来回颠倒4-6次，冰上≤5min；

（4）加入225μl solutionⅢ，来回颠倒4-6次，冰上≥5min；

（5）6000rpm/15min（或12000rpm/5min）；

（6）吸上清移入新EP管，等体积酚/氯仿抽提一次，vortex，12000rpm/15min；

（7）吸上清移入新EP管，等体积氯仿抽提，vortex，12000rpm/5min；

（8）重复步骤7）1-2次；

（9）吸上清移入新EP管，0.7倍体积异丙醇沉淀，混悬器上混匀，12000rpm/15min；

（10）弃上清，1ml70%酒精洗涤1-2次，12000rpm/5min；

（11）弃上清，空气中干燥；

（12）加入10-20μl灭菌ddH2O溶解；

（13) 加入适量RNaseA，37℃温育。

 

3.2 pGBKT7-ORF重组质粒构建

 

    取测序正确的克隆，重新摇菌、提质粒，然后用EcoRI进行酶切。酶切条件为：质粒2μl，10×H buffer 1μl,  EcoRI限制性内切酶0.5μl，加超纯水使酶切总体积增至10μl。 放置37 恒温箱中2个小时后，取4μl酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

 

 

然后用EcoRI进行大酶切。酶切条件为：质粒20μl，10×H buffer 10μl,  EcoRI限制性内切酶5μl，加超纯水使酶切总体积增至100μl。 放置37 恒温箱中2个小时后回收纯化。以同样的条件EcoRI线性化pGBKT7载体。再将此片段连入经EcoRⅠ酶切线性化的pGBKT7载体。质粒构建的具体过程见图2

 

3.3   将诱饵蛋白质转化进酵母：

      1) 挑几个酵母AIII109细胞菌落置于500μl灭菌水中，涂在YPAD平板上，30℃震荡培养过夜；

      2) 把菌落从YPAD平板上刮下来，重悬于5mL 无菌水中，将其倒入100mL YPDA液体培养基中培养至OD值为0.1；

      3) 振荡培养至OD值于0.4，30℃ 250rpm,大约5h；

      4) 将100mL 培养物分装在2只50mL 的试管中，室温下3000rpm离心5min；

      5) 弃掉上清液，将其重悬于20mL 无菌水中。

      6) 室温下3000rpm离心5min；

      7) 弃掉上清液，将其重悬于10mL TE/LiAc溶液中；

      8) 室温下3000rpm离心5min；

      9)弃掉上清液，将其重悬于175μlTE/LiAc溶液中；（温育）

     10）分装每管50μl，加入新鲜的鱼鲑精DNA,100ng质粒DNA，轻微振荡，再加入300μl PEG/LiAc溶液，轻微振荡；

     11）在30℃水中温育30min；

     12) 420 C水中热激15min；

     13) 在室温下6000～8000rpm离心20～30秒，小心去掉上清；

     14) 将细胞重悬于500μl的无菌水中，将100μl未稀释的细胞和100μl以1：10比例稀释的细胞分别涂在合适的选择性培养基上培养48～72h。

 

3.4 将文库载体转化进含有pGBKT7的酵母：

     1）选几个含有PGKBT的AI09置于50μl无菌水中，将其涂在10—cm SD/-trp的平板上，重复此过程再涂一个，放在30℃培养箱中18～24h；

     2）将所有的酵母都取下来，放入10mL 无菌水中，而后将其放入500的YPDA的液体培养基中至OD值为0.1，保留10mL YPAD的培养基作为标准值；

     3）30℃ 250rpm振荡培养至OD值0.4，通常为5h；

     4）将500mL 的酵母细胞分装在250mL 的试管中，室温下3000rpm离心5min；

     5）弃掉上清液，用100mL 无菌水重悬；

     6）室温下3000rpm离心5min；

     7）弃掉上清液，每管以50mL 用1×TE/LiAc重悬；

     8）室温下3000rpm离心5min；

     9）弃掉上清液，每管加入1.25mL 的1×TE/LiAc重悬；然后将两管倒入一管；

     10）进行25管转化，2.5mL 细胞，125μl鱼鲑精DNA，12.5μgcDNA文库，轻微的振荡，再加入15mL PED/LiAc，轻微的振荡，等分25个未来微量离心管，每管700μl；

     11）在30℃水浴中培养30min；

     12) 在42℃水中热激15min；

     13) 在室温下6000～8000rpm离心20～30秒，小心去掉上清；

     14) 将细胞重悬于400μl的无菌水中；]

     15）分别以1:1、1:10、1:100的比例将转化子涂到15cm SD/-leu-trp平板上，经过60～72h的培养，选择适当比例的平板，计算其转化效率；

     16) 将其余的转化子涂到15cm SD-leu-trp-his平板上，在30℃培养箱中培养60～72h；

3.5 阳性克隆的筛选和分析：

 

   1)将在SD-leu-trp-his平板上生长饱满的菌落挑到已经分格编号的15cmSD-leu-trp-his-ade平板上：

2) 30℃培养箱中培养60～72h,至其生长到2～3mm，挑选饱满的菌落至已画格编号的滤纸上；

3）将带有菌斑的滤纸放在一个皮氏培养皿中 ，加入10～50mL 液氮冰冻1～2min：

 4）加入X—gal显色液；

 5）30℃培养箱中温育，观察记录显色的情况，如时间和显色亮度,显蓝色的即证明具有β—半乳糖的活性；

 

3.6 酵母质粒的提取：

     1）挑取2-3mm的阳性单克隆于1.5mL  的离心管中，打散混匀，接入盛有10mL  -leu的液体培养基中，30℃ 250rpm培养过夜；

     2）待OD600>1.0时，收集菌液于3.0mL ,3000转/分离心5min；

     3）弃上清，无菌水洗涤两次；

     4）加入1.5mL 酵母裂解液I，震荡打散混匀，30℃温育30min；

     5）3000转/分离心5min；

     6）重复步骤（3）；

     7 ) 加入1.5mL 酵母裂解液II,震荡打散混匀，37℃ 温育50-60min；

     8）重复步骤（3）；

     8）加150μl已用冰预冷的溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl（pH=8.0），10mmol/L EDTA），剧烈振荡打散；

11）加300μl新配制的 溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS），轻缓混合，全过程冰上操作且≤5min；

12）加225μl已用冰预冷的溶液 III（147.2g KAc，57.5mL 冰醋酸，加水至500mL ），轻缓混合，全过程冰上操作且≥5min；

13）4℃12000rpm离心5min；

14） 吸上清，转管，加入750μl异丙醇，振荡混匀，4℃12000rpm离心15min；

15） 弃上清，加入500μl 80%的酒精洗脱，4℃12000rpm离心5min；

16） 弃上清，干燥，加20μl ddH2O溶解质粒，保存于-20℃。

 

3.7 酵母质粒的克隆

提取酵母质粒转化大肠杆菌后挑选正确克隆扩大培养后提取质粒（见一般质粒的克隆和提取及纯化 如步骤3.1）

3.8 酵母质粒的共转化验证:

该步骤和步骤3.4 将文库载体pGADT7转化进含有pGBKT7的酵母中步骤完全相同，只需要把文库载体换成提取的pGADT7质粒就可以了，如果转化的酵母可以在SD-leu-trp-his-ade平板上生长良好，则可初步验证该基因和所构建的目的基因有初步的相互作用。