整个分析用TopHat进行比对，比对完成后将比对输出作为cufflinke拼接的输入（单独拼接），将单独拼接的结果使用cuffmerge混合，然后使用cuffdiff做差异，使用r软件包CummeRbund输出差异比大的相关图形。（目前已经改版有点变化）

原有的流程如下：

现在改动的部分：

Tophat实际上就是bowtie变体，只不过bowtie只能比对DNA,tophat可以比对RNA，简单就是剪掉过内含子的序列。主要是针对可变剪切的比对，用于RNAseq定量分析，一般存在参考的注释信息。

Tophat网址：http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml

  需要事先准备的文件有：

参考基因组的fasta文件以及用bowtie建立的index文件

测序数据（fastq）

参考的转录本注释信息（gtf格式）

Usage:

tophat [options]* [reads1_2,...readsN_2] 

for example:

tophat -p 8 -G genes.gtf -o C1_R1_thout genome C1_R1_1.fq C1_R1_2.fq

-p 代表线程

-G 代表转录本注释信息

-o 输出文件夹

--segment-length 25 （将redas分成的最小比对片段）

--segment-mismatches 1 （片段比对错配碱基数）

--library-type （是否链特异性）fr-unstranded

—transcriptome-index （转录本的bowtie-index文件）

比对输出文件：

accepted_hits.bam（比对输出）

junctions.bed

insertions.bed and deletions.bed

＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃

cufflinks拼接

Usage: cufflinks [options]*

for example:

cufflinks -p 8 -o C1_R1_clout C1_R1_thout/accepted_hits.bam

cufflinks -p 8 -o C1_R2_clout C1_R2_thout/accepted_hits.bam

cufflinks -p 8 -o C1_R3_clout C1_R3_thout/accepted_hits.bam

cufflinks -p 8 -o C2_R1_clout C2_R1_thout/accepted_hits.bam

cufflinks -p 8 -o C2_R2_clout C2_R2_thout/accepted_hits.bam

cufflinks -p 8 -o C2_R3_clout C2_R3_thout/accepted_hits.bam

建立一个文件命名为：assemblies.txt,assemblies.txt内容如下：

./C1_R1_clout/transcripts.gtf

./C2_R2_clout/transcripts.gtf

./C1_R2_clout/transcripts.gtf

./C2_R1_clout/transcripts.gtf

./C1_R3_clout/transcripts.gtf

./C2_R3_clout/transcripts.gtf

运行Cuffmerge:

cuffmerge -g genes.gtf -s genome.fa -p 8 assemblies.txt -o /merged.gtf

输出产生一个GTF文件:merged.gtf

运行Cuffquant：

Usage: 

cuffquant [options]*

参数：-o/—output-dir 输出目录，默认为当前目录

输出文件：abundances.cxb

运行Cuffdiff：（计算每个样本基因、转录本的FPKM）

组与组比较：

cuffdiff --use-sample-sheet

sample_sheet.txt内容如下：

sample_id group_label

C1_R1.sam C1

C1_R2.sam C1

C2_R1.sam C2

C2_R2.sam C2

如果两个条件之间比较：-C   

condition_A condition_B

Ctrl Mutant_X

Ctrl Mutant_Y

Ctrl Mutant_Z

名字的命名至少匹配样本名称

以前版本的命令：

cuffdiff -o diff_out -b genome.fa -p 8 –L C1,C2 -u merged_asm/merged.gtf 

            ./C1_R1_thout/accepted_hits.bam, ./C1_R2_thout/accepted_hits.bam,

./C1_R3_thout/ accepted_hits.bam

./C2_R1_thout/accepted_hits.bam,./C2_R3_thout/accepted_hits.bam,./C2_R2_thout/ accepted_hits.bam