1.测序结果中出现套峰的原因是什么？

模板或引物因素都可能导致套峰的出现，可能原因主要包括以下几点：

1)测序引物在模板上有两个结合位点。

2)模板不纯，如质粒或菌液为非单克隆，或PCR产物为非特异性条带。

3)模板序列存在特殊结构，如Poly结构、发卡结构等。

4)引物降解、不纯或特异性不好。

2.样品在送测前已鉴定过存在插入片段，为什么测序结果却显示为一个空质粒？

造成这种现象主要有以下两个原因：

1)鉴定过程中出现假阳性。插入片段的鉴定主要是采用PCR和酶切两种方式。由于PCR反应受多种条件影响，在鉴定过程中易产生假阳性，相对而言，酶切鉴定的结果更为可信。

2)由于条件的限制，我们无法单独地对合作伙伴的样品进行特定条件的培养，所以插入片段可能在培养过程中丢失。直接提供质粒虽然可以避免这种情况的发生，但由于质粒制备上的问题，测序的成功率可能会受到影响。

3. 当DNA片段很长时，如何获得全长序列？

若DNA片段在载体上，可用载体上两端的引物同时测序，通过拼接获取全长序列。若通过两端引物同时测序仍没有overlap，可进行Primer Walking，即在已测出序列的450～500个碱基处设计测序引物进一步测序，从而测通DNA片段。

详见美吉生物网站：http://www.majorbio.com/