C2c2：一种靶向RNA的新型CRISPR系统

 

导语来自麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所、麻省理工学院、美国国立卫生研究院、罗格斯大学新布朗斯维克分校和俄罗斯Skolkovo理工学院的研究人员，确定了一个靶向RNA而非DNA的新型CRISPR系统的特征。研究结果发表在《科学》（Science）杂志上。

 

CRISPR免疫应答系统

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats RNA，是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，第一次是在1987年在大肠杆菌中有报道，到2000年时，有人证实了，目前为止，已有40%已测序的细菌和90%已测序的古细菌中有报道。CRISPR含有一个与噬菌体和质粒同源的短的重复序列，通过对外来同源的DNA作用对噬菌体有抗性，影响质粒的连接，是原核生物的免疫系统一部分。

阶段1：外源DNA采集

外源核苷酸是通过Cas蛋白来识别的，入侵的短片段DNA（30-50个碱基对）被称为protospacers，作为间隔序列插入宿主CRISPR位点中，由重复序列隔开。对于I型和II型系统来说，protospacers来自入侵DNA中两侧出现2-5个核酸结构（PAM，protospacer adjacent motif）的区域。一般protospacers连接在CRISPR 位点的一端，并且后者通过涉及Cas1、Cas2和游离3’-hydroxyls等元件的机制，牵引序列。Protospacer的整合过程中也出现了牵引末端重新序列复制，这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。

阶段2：crRNA合成生物

CRISPR RNA生物合成在转录之后，生成初级转录产物：pre-crRNA，之后经过加工，又成为一组短小的CRISPR 衍生RNAs（crRNAs），这些crRNAs每一个都包含有对应于之前遇到的外源DNA的对应序列。

阶段3：靶向干扰 

成熟的crRNAs能指导Cas蛋白靶向互补靶标，靶标序列由专用Cas 核酸酶降解，但其靶标降解的机制存在差异。I型和II型系统都可以靶向包含PAM和protospacer互补序列的dsDNA底物。III型系统则不依赖于 PAM作为识别序列，而是通过导向序列延伸至crRNA信号5'handle的核苷酸进行识别（CRISPR位点包含与导向序列，5'handle互补的序列），并阻止靶向切割。

CRISPR–Cas系统最新的进化分类

CRISPR-Cas系统中Cas基因进化速度最快，根据单亚基和多亚基的crRNA效应复合物定义将CRISPR-Cas系统分类量大类：class I和class II

class I包括三个亚型：Type I，Type III和Type IV

classII包括两个亚型：TypeII和Type V

 

class II 多个亚型中发现C2c2

 

2015年10月，张锋博士与Eugene Koonin合作发现了自然存在的、具有基因组编辑潜力的三个新系统：C2c1、C2c2和C2c3。发现以及确定这些系统的特征有望进一步扩大基因组编辑工具箱。

C2c2基于BLAS方法进行进化的分类

在张锋的class 2新发现系统中C2c2位于细菌Leptotrichia shahii class 2的Type VI位置

L. shahii C2c2 locus在E.coli细菌中功能重构赋予RNA指导的免疫反应

1.第一步设计靶向ssRNA（单链RNA）MS2噬菌体基因组，覆盖所有可能的28nt tiled sapcers（平铺的间隔序列）

 

2.覆盖所有可能的28nt tiled sapcers（平铺的间隔序列）质粒库构建

 

3.用间隔序列质粒库转化E.coli然后加入MS2噬菌体，筛选抗性的E.coli,然后通过深度测序分析剩余的crRNA pool.

C2c2调控RNA指导的单链RNA的断裂

深度测序发现了C2c2是RNA指导的ssRNA发生断裂效应物。

C2c2的HEPN结构域调节RNA指导的ssRNA的断裂。

C2c2指导的断裂位点是由靶标RNA的二结构和序列组成决定

LshC2c2可以调控特异mRNA的knockdown(RNAi)

针对RFP荧光蛋白基因，在C2c2表达情况设计crRNA，通过流式细胞仪分析能够有效降解mRNA表达，影响RFP荧光强度。

LshC2c2指导的单链RNA断裂激活LshC2c2的非特异性RNase活性

LshC2c2断裂靶标单链RNA以外，还可以断裂collateral RNA,表明它具有非特异的RNA酶活性，从而降解其余的一些单链RNA分子，会产生一定的毒副作用。

LshC2c2 RNA编辑具有广泛的应用前景

1.添加一些模块到特定RNA序列中改变它们的功能（翻译成蛋白质的方式），这将使得它们成为用于大规模筛查及构建合成调控网络的有价值的工具。

 

2.利用C2c2荧光标记RNAs作为一种方法来研究RNA的运输和亚细胞定位

。

3.利用细胞器官特异性的RNA domain影响RNA的细胞定位。

 

在这项工作中，研究小组利用C2c2精确地靶向及除去了特异的RNA序列——降低对应蛋白质的表达水平。这表明C2c2可以代表siRNA的一种替代方法，补充基于CRISPR的DNA编辑的特异性和简便性，提供给研究人员一种利用RNA的可调节基因“敲低”能力。C2c2特异性和非特异性断裂，在抑制肿瘤细胞生长，肿瘤细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）和肿瘤细胞休眠方面有一定应用。

C2c2具有的一些优点使得它适合于工具开发：

1.C2c2是一种双组件系统，只需要一条向导RNA来发挥功能

2.C2c2遗传上可编码——这意味着可将必要元件合成为DNA传递到组织和细胞中。

 
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