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基因表达受到转录水平调控，包括染色质重构以及转录因子的移动；转录后水平调控，包括pre-miRNA剪接，5’加帽，3’多聚腺苷加尾，编辑，mRNA输出，定位和翻译。这些过程受到DNA结合蛋白，RNA结合蛋白，和非编码RNA的控制。最近几年，lncRNA被发现可以作为转录，mRNA代谢以及蛋白稳定性得到重要调控因子。

虽然调控功能是通过与靶标DNA和RNA序列以序列互补的方式进行作用，但是大部分lncRNA功能的发挥是通过与DNA结合蛋白以及RNA结合蛋白进行相互作用来实现。

RNA结合蛋白与RNA复合物可以用很多方法进行研究，例如特定的RNA结合蛋白与特定RNA可以通过传统的核糖核蛋白免疫共沉淀（RIP）复合物，生物素化的RNA pull down复合物，RNA凝胶迁移滞后实验。全局性分析mRNA与RNA结合蛋白相互作用可以通过RIP后cDNA芯片分析，或者RIP后RNA-seq分析。之后，RNA结合蛋白用UVC（254nm）交联后免疫共沉淀（CLIP）方法被研发，开始时候结合Sanger测序，后来使用CLIP cDNA文库的高通量测序方法（RNA-seq）。进一步方法学改进，。光激活核糖核苷增强型CLIP分析，该方法使用核糖核苷模拟物4巯基尿嘧啶（4-SU）或者6巯基鸟嘌呤（6-SG），通过将其暴露在365nm紫外光下来激活。可替代性的方法还包括CLIP，该方法可以做到单核苷精度，用反转录酶，交联，连接以及杂交体测序（CLASH）方法监测RNA与三联复合物的RNA内部的相互作用。

虽然RNA结合蛋白与RNA相互作用检测方法取得了巨大进步，高通量分析需要制备一个小RNA的文库，因此耗费大量的人力，财力，时间和优化过程。除此之外，大量的生物信息学分析来读取序列和鉴定结合位点。因此，开发一种方法结合PAR-CLIP和qPCR方法来获取lncRNA与RNA结合蛋白在100nt间隔精度范围的结合位点的图谱。该方法流程图如下：

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方法提示：

1.如果对于常规的RNA结合蛋白与RNA UV暴露交联不成功，可以选择甲醛交联方法

2.RNaseT1酶的量和孵育时间对于本实验最为关键。优化参数是为了获得100-300nt片段（主要是从18S到28S核糖体RNA范围）对于CLIP-qPCR分析是关键步骤。高丰度的RNA（比如MALAT1和NEAT1），大量的RNase以及更长的孵育时间可以尝试。

3.引物设计来说，200nt间隔的RNA片段可以选择1-200,101-300，201-400,301-500。qPCR引物覆盖全长的转录本。如果全长的RNA在公共数据库中没有注释的话，应该用RACE方法获取全长。

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