导语

 

 

长链非编码RNA（lncRNAs）与染色质的关联从而调节基因表达，但他们如何靶向染色质仍然知之甚少。来自瑞典的科学家运用染色质RNA免疫沉淀偶联的高通量测序方法从乳腺癌细胞中发现276个lncRNAs富集在异染色质中。挑选其中一个与染色质相互作用lncRNAs，MEG3，科学家们探索通过lncRNAs靶向染色质的机制。研究表明MEG3和EZH2分享共同的靶基因，其中包括TGF-β通路基因。MEG3全基因组结合位点的图谱显示，MEG3通过结合到远端调控元件调节TGF-β通路基因的活性。MEG3结合位点有丰富的GA序列，它通过RNA-DNA三联体结构的形成引导MEG3靶向染色质。他们的研究发现，RNA-DNA三链体结构的形成可能是一种通过lncRNA与染色质相互作用进行靶基因识别的通用机制。

Nature communication》数据量不小啊！

大牛技术1：染色质免疫沉淀CHIRP-Seq

介绍一下这个大牛技术：CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白的高通量测序方法。方法是通过设计生物素或链霉亲和素探针，把目标RNA拉下来以后，与其共同作用的DNA染色体片段就会附在到磁珠上，最后把染色体片段做高通量测序，这样会得到该RNA能够结合到在基因组的哪些区域；如果结合物是蛋白质，可以通过将蛋白质打断成短肽再通过质谱进行鉴定，从而或者与RNA结合的蛋白质。RNA Pull down技术与此类似。

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选择了大牛的技术，还有有精细的思路呀！

精密设计2：

H3K27甲基化修饰被认为主要与转录抑制相关, 主要存在于具有PolycombResponse Elements(PREs)的常染色质区, 中心粒异染色质区以及失活的X染色体上。可催化H3K27发生甲基化的酶为EZH2。可以与甲基化H3K27结合的效应分子是Polycomb。Polycomb Repressive complex(PRC)家族的主要成员有PRC1和PRC2,Polycomb主要存在于PRC1复合体中。

由此选择2个抗体做研究：

1：抑制性染色质标记H3K27me3

2：可催化H3K27发生甲基化的酶EZH2

关键哦！

找出了差异lncRNA转录本还得找到大家认识的啊，再交集一次，吼吼！

http://mmbiz.qpic.cn/mmbiz/RSvVSR9fTQTrLMh0frOlHJ38Gaic9qWfKEf8mzRUpicoiaUhmPzHnJTVJvgx9owhWHVxubtAx7epO7NBe5joBHXibw/640?wx_fmt=jpeg&wxfrom=5&wx_lazy=1

MEG3,KCNQ1OT1,BDNF-AS1，这些大家都看得懂的哦！找典型来研究啦，MEG3,KCNQ1OT1,BDNF-AS1这些大家最熟悉了，特别好做啦，就选它们了！来要做哪些工作了呢？

都是一些套路啦！

首先你得说明lncRNA与EZH2是如何作用的吧？

第一步：这些lncRNA在哪里的问题，嘿嘿！当然是FISH啦！

http://s6/mw690/002lWhsAgy6UHe9OSsBc5&690

第二步：要说明lncRNA与这个EZH2 mRNA在空间上是共定位的，还得来一个细胞质和细胞核级分的qRT-PCR

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第三步：这些选出来的小鸟依人的RNA（MEG3,KCNQ1OT1,BDNF-AS1）到底与我这个主霸王（EZH2）是不是有身体接触,而且是活生生的接触哦？

这里就得RIP上场了。（RNA Immunoprecipitation (RIP) 是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA，lncRNA等等调节靶点。这种技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行测序分析或者qRT-PCR分析。

http://s7/mw690/002lWhsAgy6UHebMiAC56&690

了这么久的实验，就一张这鸟图，科研真是累啊！

第四步：MEG3与我小霸王（EZH2）有身体接触,是哪里接触的，是否造成实实在在的侵犯啊？科研人员干上了法医工作！

我把你MEG3大卸八块，看看有哪里出毛病了！

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第五步：我把你MEG3大卸八块，找到了一块地方是侵害的部位！找到了侵害部位还不行啊，老兄，我还得证明你实实在在的，在伦理道德上，身体反应上的的确确发生了常识的侵犯！容易嘛？还得继续啊！

这里得用RNA-pull down技术啦！做lncRNA不知道，RNA-pull down，说明你文章档次都在5分以下啦！得努力啊！

http://s14/mw690/002lWhsAgy6UHeeA3FPed&690

你侵犯我，你得实实在在有犯罪行为，把我拉下来啊！接下来：

A：sense WT MEG3拉一遍

B：antisense WT MEG3拉一遍

C：关键部位去掉再拉一遍

好累啊！

第六步：你们有身体接触，汽车上也经常有刮擦，自然现象啊，你得证明你是主动还是被动刮擦，刮擦力度达到了主观的故意吗？逻辑清晰啊！

所以体内继续过表达野生型，突变型的质粒，看看结合效率有没有差异，力度够不够强哦！

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第七步：MEG3和EZH2你们相互是接触了，接触后干了哪些勾当啊？我得深挖到底!

这就需要设计一个小实验了！

我将你MEG3和EZH2用siRNA技术干扰掉，让你MEG3和EZH2没有力气发挥作用了，小编做个广告：艾博思生物的RNAi技术是领先的哦！别忘了看了文献联系小编买试剂！

SiRNA干扰以后，用基因芯片找出哪些基因发生变化，这些变化属于哪些信号通路？这样文章就好继续往下讲故事了！

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你们干一票时候，你们是合伙干的还是单独干的，我们已经认为你是合伙干的这一票，所以我得找MEG3 siRNA和EZH2 siRNA的交集，证明你们是合伙干了后续的勾当，这些勾当导致了严重的后果！

做了很多勾当，这些勾当是我们大家耳熟能详的，先给你列出这些罪状：

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第八步：这些罪证哪些是可以判刑的啊？当然有很多，先找这些可以判很多年的！

那当然凭着经验和大量的数据证据选择TGF-b通路啦！

接下来，你说是TGF-b通路，大家不是2b，得用2b方法来验证啊，qRT-PCR，WB，transwell你都得做做！

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第九步：这些2b的事情做完了怎么办？完事了？这可是《nature communication》11.47分，上了10分的文章可不是这么容易搞定的！继续苦逼的往下做吧！

下面介绍一个大牛的技术：CHOP技术chromatin oligo-affinity precipitation assay(ChOP)，染色质寡核酸亲和沉淀分析。相当于ChIP assay的一个修改版，这里用的是生物素话的oligos！

http://s10/mw690/002lWhsAgy6UHej3Zcl09&690

文章工作量了得，花了多少money啊？

首先得发现的确是在TGF-b通路基因表达发生明显的减少！并且用CHIP-qRT-PCR和3C-qRT-PCR验证并且找到他们的结合位点。

第十步：MEG3与TGF-b通路基因结合有什么特点？就像侵犯了别人，有印痕，有伤疤！

A. 发现这些位置GA含量很高！

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B. 发现这些位置形成了RNA-DNA在体外和体内都形成了三联体结构！

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http://s2/mw690/002lWhsAgy6UHekXbjP61&690

第十一步：MEG3形成RNA-DNA三体结构，MEG3与PRC2也结合，他们的作用是一致吗？

原来不一样哦，是有先后次序和功能分工的，MEG3先将PRC2募集过来，然后与染色质形成MEG3 RNA-DNA三体复合物。

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