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(2013-07-18 11:09:39)
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lncrnarnai脱靶效应效率低下pcr |
分类： 上海艾博思生物科技有限公司 |
艾博思生物《lncRNA干扰之我见（二）》
I.如何确认你的lncRNA的确RNAi？
1、优化siRNA转染效率，用FAM，cy3等荧光标记siRNA，在2种以上的细胞系，对不同时间点，和不同siRNA量进行检测
2、用阳性对照的GAPDH来优化siRNA沉默效率，例如GAPDH,B-actin，P53等等
3、针对lncRNA特异的siRNA?所以一般来说至少设计3-5条siRNA序列针对目标lncRNA，尽量避免脱靶效应
4、qRT-PCR或RT-PCR同时，在2-3个位置评估lncRNA的干扰效率，当然设置严格的siRNA NC
II、遵循上述原则同样遇到以下问题：
1、GAPDH siRNA得到满意的干扰效果，但是lncRNA无法被干扰，甚至上调了？
2、目标lncRNA干扰效率低于20%，但是很多文献报道的干扰效率达到了23%-70%不等？
3、mock和阴性对照组产生了干扰效应？
III、遇到以上问题的应对策略
1、并非所有lncRNA是可以得到好的干扰效果的。如果当你在阳性对照得到了80-90%抑制效率，lncRNA设计了5-8条序列都没有好的干扰效率，那么lncRNA很难被干扰，可能与RNA结构和相关作用蛋白以及作用通路的机理有关，建议使用其他的方式进行抑制。
2、推荐用RNAi Max转染试剂（invitrogen）进行转染条件的优化《艾博思生物代理有售》
注意：特别对于参与免疫反应途径，转染试剂低毒性特别重要，容易造成系统性毒性反应。
3、siRNA浓度可以扩大一些范围摸索，在50-100之间
4、适当时候可以将3-4个甚至更多的siRNA按照15nM每条进行混合，同时进行转染
5、条件允许情况下用Exiqon的 LNA GAPMER进行反义核酸的抑制《艾博思生物代理有售》
6、适当时候分级细胞成分，可以用PARIS™ Kit(Ambion®)《艾博思生物代理有售》
7、lncRNA很多表达丰度很低，由于lncRNA目前检检测方法在RNA本身，所以一定确保PCR反应体系稳定性，重复性和可信度，筛选时候用SYBR染料法，在二次确认情况下，条件允许情况下使用taqman探针法进行检测
8、lncRNA种类很多，结构复杂，转录本重叠度很高，在设计PCR引物的时候，一定找到特异的可区分度的lncRNA区域，并且注意lncRNA有很多反义转录本干扰标靶的检测准确性。BLAST和RNA二级机构分析可以减少误差形成。
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