加载中…自噬体介绍
(2013-07-07 20:07:34)
标签：
自噬自噬体研究方法教育 |
分类： 上海艾博思生物科技有限公司 |
细胞自噬研究
定义
细胞自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物）或液泡（酵母和植物 ）中进行降解并得以循环利用。
形式
细胞自噬主要有三种形式：微自噬（microautophagy)、巨自噬（macroautophagy）和分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA）。
微自噬
定义：指溶酶体或者液泡内膜直接内陷将底物包裹并降解的过程。
作用时间：多在种子成熟时储藏蛋白的沉积或萌发时储存蛋白的降解中起作用。
巨自噬
定义：在其过程中，底物蛋白被一种双层膜的结构（粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜）包裹后形成直径约400~900纳米大小的自噬小泡（autophagosome)，接着自噬小泡的外膜与溶酶体膜或者液泡膜融合，释放包裹底物蛋白的泡状结构到溶酶体或者液泡中，并最终在一系列水解酶的作用下将其降解，我们将这种进入溶酶体或者液泡腔中的泡状结构称为自噬小体。
作用时间：营养缺乏条件下培养的细胞、植物的免疫反应、叶片衰老及环境胁迫应答。
在动物细胞衰老反应过程中，往往发生分子伴侣介导的自噬过程，保存必须的组成细胞结构的蛋白和其他材料。
揭示机制
加州大学圣地亚哥分校的管坤良教授领导的一支研究团队揭示了调控细胞自噬的一个关键分子机制，研究人员发现，AMPK酶，不仅参与了细胞的传感和能量调控，而且在细胞自噬酶作用方面，也扮演了重要角色。细胞自噬是细胞在恶劣条件下确保其生存的基本应激反应。
研究人员发现，AMPK能以不同的方式，调控一种称为Vps34激酶家族不同的复合物，一些Vps34酶参与了正常细胞的囊泡运输——细胞中一种重要的分子运输，还有一些Vps34复合物则参与了细胞自噬。管教授与其同事们发现，AMPK能抑制那些未参与细胞自噬的酶，而激活参与细胞自噬的Vps34酶。
意义
细胞自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是十分重要的生物学现象，参与生物的发育、生长等多种过程。细胞自噬的异常导致癌细胞的出现。
研究方法
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：
一、自噬诱导剂
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
(5) Rapamycin：mTOR抑制剂
(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
二、自噬抑制剂
(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂
(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal
lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）
除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
三、自噬过程进行观察和检测
细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
1、电镜观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic
vacuole，AV）
2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
3、利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成
自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
（注意：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）
4、检测长寿蛋白的批量降解：非特异
5、MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
6、CellTrackerTM
Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
四、自噬相关蛋白的定位
在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：
Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。
Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。
Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔
（注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理。）
Autophagy Antibody Sampler Kit #4445
| Kit Includes | Quantity | Applications | Reactivity | MW (kDa) | Isotype |
|---|---|---|---|---|---|
| Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb #3495 | 40 µl | W IP | H M R Mk | 60 | Rabbit IgG |
|
LC3A (D50G8)
XP® |
40 µl | W IHC-P IF-IC F | H M R (Mk) (Dg) | 14, 16 | Rabbit IgG |
|
LC3B (D11)
XP® |
40 µl | W IP IHC-P IF-IC F | H M R (Mk) (B) (Pg) | 14, 16 | Rabbit IgG |
| Atg5 (D1G9) Rabbit mAb #8540 | 40 µl | W IP | H M R Mk (B) (Dg) (Pg) | 55 | Rabbit IgG |
| Atg12 (D88H11) Rabbit mAb #4180 | 40 µl | W IP | H M R Mk | 16, 55 | Rabbit IgG |
| Atg7 (D12B11) Rabbit mAb #8558 | 40 µl | W IP | H M R (Mk) (B) | 78 | Rabbit IgG |
| Atg3 Antibody #3415 | 40 µl | W | H M R Mk (C) (X) (B) (Dg) | 40 | Rabbit |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 | 100 µl | Goat |
======================================================================================
上海艾博思生物科技有限公司
Shanghai Integrated Biotech Solutions Co.,Ltd.
电话：021-38770863（座机）
传真：021-38770863
QQ:1592003379(sales)
QQ群：31542877
地址：上海浦东张江高科园区紫薇路750弄10号202室
邮编：201203
http://www.ibsbio.com
http://blog.sina.com.cn/ibsbio
技术服务：RNAi服务，miRNA服务，lncRNA服务，荧光定量PCR、SNP检测(测序法/荧光PCR法)、转录组/外显子组/小RNA高通量测序(454、Hiseq-2000)、基因芯片服务，miRNA芯片服务、引物探针设计与合成分子生物学产品：RNAi、miRNA、RNAi文库、miRNA文库、慢病毒、荧光定量PCR Mix，酶、核酸纯化等产品
代理品牌
免疫学：抗体及其ELISA试剂盒-------Abcam、Epitomics、Biovision、Biorbyt、Abgent（全面的免疫学产品）、Santa Cruz、CST、R&D
荧光类：SYBR/Biotium (核酸凝胶染色试剂、EvaGreen荧光染料、CF染料等荧光试剂）
动物类：各种动物模型
综合类：Corning/Axygen/BD/FISHER（耗材）、MERCK、Millipore、Invitrogen、Roche、Sigma等
仪 器：各种类型小型仪器等
特色服务：整合外包试验、课题外包服务、课题合作服务等等
喜欢
0
赠金笔