shRNA干扰服务

服务简介：

shRNA-Target Gene表达载体构建好后，即可进行RNA干扰实验。

shRNA RNAi试验设计理由:

1.  shRNA表达载体目的细胞转染效率的检测。

如果目的细胞的质粒转染效率较低(低于70%) ，则应采用慢病毒或者腺病毒包装，病毒具有高感染率、高表达特性，在高效的侵染效率的情况下，才能进行RNA干扰实验。

2.  对照设置与分组

shRNA NC(阴性对照序列，排除非特异性效应)

shRNA GAPDH(阳性对照序列，排除系统性的误差)

shRNA Target1-4(靶基因序列)

mock(转染试剂对照组，排除转染试剂的毒性效应)

3.  RNA干扰效率的检测(体外)。

一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。

mRNA 水平：RT-PCR、Real-Time PCR；

蛋白质水平Westem-Blot、ELISA 、免疫组化；

细胞表型水平MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等。

4.  RNA干扰效率在动物模型上的进一步验证(体内)。

动物模型实验同以采取"体内法"和"体外法"。

体内法，即先做裸鼠成瘤模型，再将质粒或病毒导入裸鼠，检测RNA干扰效果。此法操作复杂，对质粒和病毒产品的质和量要求都较高，但是比较贴近实际，说服力较显著。

体外法，即先将质粒或病毒导入肿瘤细胞，再将肿瘤细胞导入动物体内，然后检测阳RNA干扰效果。此法操作较简单，对质粒和病毒产品的质量要求较低。

TIPS:RNA干扰实验中的对照

按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照:

1.  转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；

2.  nonsense siRNA对照（监控外源核酸本身对结果的影响）；

3.  positive siRNA对照（监控假阴性）；

4.  技术重复对照（也叫off-target 对照，也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验，2个siRNA互为off-target control，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的knockdown效应）；

5.  rescue对照（knockdown之后做超表达，看是否有性状的逆转，这也是为了说明knockdown的特异性）；

实际实验中，全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中，①、②两种对照即所谓的空白细胞对照、NC对照，基本是所有杂志都要求具备的。④、⑤两种对照， 主要是为了解决off-target效应，选做一种即可， 一般建议选⑤，涉及的实验即所谓的“RNA干扰回复实验”，本公司针对这一实验，有专门的“RNA干扰回复试验指南”，详情请参见相关内容。

服务价格与周期:

服务1：

有效shRNA靶点筛选套餐：8000元

服务周期3-4周

服务2：

保证有效套餐 2600元，4个载体。

客户须知:

1.  进行RNA干扰主体实验前，最好先通过预实验确定目的细胞的质粒转染效率。如目的细胞的质粒转染效率大于70%，则可采用质粒形式载体:如目的细胞的质粒转染效率低于70%，则建议采用慢病毒或者腺病毒。如目的细胞的质粒转染效率低于70% ，而客户坚持使用质粒形式的载体进行RNA干扰主体实验，则本公司不保证shRNA的干扰效果；

2.  如shRNA序列由客户提供，或shRNA序列由本公司提供，但未在本公司进行有效shRNA筛靶实验，本公司不保证所采用的shRNA一定有效；

3.  Western-Blot实验中，如一抗采用国产抗体，本公司不保证一定会获得正确结果；

4.  本公司保证所提供的实验数据真实、准确，但不保证实验结果一定符合客户预期。