使用siRNA、miRNA mimic 、pre-miRNA 进行miRNA 生物学功能研究的区别

miRNA 是一类大小约为22 个碱基的小RNA 分子。它们在转录后阶段对基因表达进行调控。调控机制是通过与靶基因的mRNA 互补序列结合，抑制蛋白质的 翻译或降低mRNA 的稳定性，从而抑制靶基因的表达。科研人员已逐步认识到miRNA 在细胞的发育，分化，生长等生命活动中起着非常重要的调控作用，因此越来越多的科研人员把目光聚焦到这一领域，并期待能一窥miRNA 的科学奥妙。 

成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，初级转录物称为pri-miRNA。pri-miRNA 长度从几百到几千个碱基不等，带有5‘帽子和3’polyA 尾巴，以及1 到数个发夹径环结构。Pri-miRNA经剪切产生约70 个碱基的miRNA 前体，即pre-miRNA。pre-miRNA 为单一发夹结构，5‘带有磷酸基团，3’有两个突出碱基，并带有3’羟基。pre-miRNA 经进一步剪切，形成长度约为22 个碱基的单链成熟miRNA。

由于当前市场上的miRNA 产品类型有诸多不同，因此对于初入此领域的科研人员来说，选择哪种形式的miRNA 进行科研试验往往成为困惑。除了构建miRNA 表达载体外，市场上人工合成的miRNA 产品主要有siRNA，miRNA mimic，pre-miRNA等几种设计类型，实际上不同的类型各有优缺点，科研人员应该根据试验的不同要求来进行选择，从而得到最想要得到的结果。 

一般来说，采用miRNA 表达载体能获得稳定表达miRNA 的细胞株，但也存在质粒的转染效率要低于RNA oligo，无法定量转染，过表达影响细胞内非靶基因/功能等缺点，因此目前很多研究miRNA的科研人员都选择直接转染物美价廉的人工合成miRNA 产品。miRNA 产品中的siRNA ， miRNAmimic 都是基于内源性pre-miRNA 的成熟形式设计而来，从而使其具备miRNA 生物学功能并应用于miRNA 的功能分析研究，但这些设计也会不同程度的影响细胞或体内的非靶基因/功能。为尽可能降低上述脱靶效应，miRNA mimic 往往还对核苷酸进行特定修饰，从而筛选出最接近pre-miRNA 生物学功能的序列设计，但是通常情况下其功能性及特异性仍稍逊于pre-miRNA。pre-miRNA 虽然具备独特的优势，但是因为当前RNA的合成工艺一直无法有效突破50 个碱基左右的瓶颈，所以其价格成本较高。 

已有文献报道表明，等量的miRNA mimics 和pre-miRNA 进入体外或体内时，pre-miRNA能更特异地且高效的形成mature miRNA，并表现出更高的生物学活性。Richard I. Gregory 等在体外将pre-let-7 和let-7 duplex 分别与Dicer-TRBP-Ago2 共孵育，然后加入靶RNA 进行反应。结果表明pre-miRNA 对靶RNA 的剪切活性明显优于miRNA duplex。Daniela Castanotto 等用siRNA、shRNA、pre-miRNA 分别或联合转染细胞研究表明，pre-miRNA 不仅与外源iRNA/shRNA存在的竞争性抑制最小，而且对内源性其它miRNA 的影响也最小。其原因可能是shRNA/siRNA挤占细胞内有限的RISC资源，而pre-miRNA具备高特异性序列结构避免过度侵占细胞内部资源。 

由于miRNA 为内源单链RNA，对依赖双链RNA 的蛋白激酶（PKR）和寡腺甙酸合成酶（2',5'- oligoadenylate synthetase，2-5A）干扰素诱生系统不敏感，PKR 和2-5A 系统只能特异地与双链RNA 结合，不能与单链或RNA-DNA 杂交链结合，因此pre-miRNA 在in vitro/in vovo 水平上能一定程度的避免细胞毒性，进而减少细胞凋亡。 

Carol A. Sledz 等研究表明短链dsRNA 也会诱导产生干扰素效应，虽然这种效应有时候比较弱，但是其具有普遍性且呈剂量依赖性。M Bauer 等则通过模拟内源pre-miR-30 序列结构设计出amiRNA（artificial miRNA），其有效降低了shRNA 的干扰素效应，干扰素相关基因Oas1 及凋亡蛋白caspase 3 均得到下调。鉴于pre-miRNA 具有高效、低细胞毒性的特点，我们合成了pre-miR-21 和miRNA mimic，以相同剂量转染细胞，然后用RT-PCR 检测miRNA-21 成熟体的形成。试验结果表明效果远优于mimics，因此pre-miRNA 在系统多因素的研究中具备其更独特的优势！

Reference：

1.Yoshinobu Shiba,et al,Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM)as the 2’-O-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110merprecursor-microRNA candidate Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 10 3287–3296.

2.David Brown et al，Metheds and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules,patent:US8,058,250.

3.Daniela Castanotto et al, Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selectiveincorporation into RISC Nucleic Acids Research, 2007, (35), 5154–5164.

4.Kazuya Terasawa et al，Synthetic Pre-miRNA-Based shRNA as Potent RNAi Triggers Journal of Nucleic Acids（2011）, 1-6。

5.Dirk Grimm et al, Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathwaysNature 2006( 441),537-541.

6.Richard I. Gregory,et al,Human RISC Couples MicroRNA Biogenesis and Posttranscriptional Gene SilencingCell, Vol. 123, 631–640, November 18, 2005.

7.M Bauer et al，Prevention of interferon-stimulated gene expression using microRNA-designed hairpins GeneTherapy (2009) 16, 142–147.

8. Onsam Sin et al,Gene Silencing Efficiency and INF-b Induction Effects of Splicing miRNA 155-Based ArtificialmiRNA with Pre-miRNA Stem-Loop Structures, Biochem Genet (2012) 50:112–121.

9. Carol A. Sledz et al Activation of the interferon system by short-interfering RNA, Nature Cell Biology 2003(9)834-839.

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