加载中…稳转细胞系构建
(2013-03-14 15:17:38)
标签：
艾博思生物稳定转染细胞系构建教育 |
分类： 上海艾博思生物科技有限公司 |
稳转细胞系
定义：稳定转染就是转染的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进行细胞传代，从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。 筛选稳定细胞系有两种方法：
1）转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系；
2）慢病毒感染筛选稳定细胞系。慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。
应用：观察目的基因及其表达蛋白在某种细胞中的功能（稳定，可长期进行研究）
1）转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系；
2）慢病毒感染筛选稳定细胞系。慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。
应用：观察目的基因及其表达蛋白在某种细胞中的功能（稳定，可长期进行研究）
应用范围：
1）基因过表达服务
2）shRNA
干扰服务
3）miRNA过表达
4）任意非编码基因的过表达
一般流程：
1）筛选浓度测定：以10~14天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度
2）细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖
3）细胞转染（病毒、脂质体、电穿孔、FuGENE 6、PEI等等）
4）利用质粒上含有的抗性选择进行筛选
5）鉴定筛选结果
2）细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖
3）细胞转染（病毒、脂质体、电穿孔、FuGENE 6、PEI等等）
4）利用质粒上含有的抗性选择进行筛选
5）鉴定筛选结果
筛选鉴定评价标准：
一般用qRT-PCR鉴定
客户可以选择鉴定方法，但是筛选的费用做相应的调整！
前期需要准备：
1、构建好的外源基因载体，target gene载体，shRNA载体，miRNA载体，ncRNA载体
2、待转染的细胞系（1×106个细胞，可传代，倍增时间小于48小时）以及细胞培养条件的说明
3、若需要检测靶基因的表达变化，请提供相应抗体
结果呈现：构建好的稳定表达细胞系及相关的外源基因表达分析，干扰的效果分析等等！
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Mix，酶、核酸纯化等产品
代理品牌
免疫学：抗体及其ELISA试剂盒-------Abcam、Epitomics、Abgent（全面的免疫学产品）、Santa
Cruz、CST、R&D
荧光类：SYBR/Biotium
(核酸凝胶染色试剂、EvaGreen荧光染料、CF染料等荧光试剂）
动物类：各种动物模型
综合类：Corning/Axygen/BD/FISHER（耗材）、MERCK、Millipore、Invitrogen、Roche、Sigma等
仪
器：各种类型小型仪器等
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