一、 miRNA测序概述

microRNA(miRNA)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70—90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达（最新发现microRNA也能在转录水平调控基因表达）。microRNA在物种进化中相当保守，在动物、植物和真菌等中发现的microRNA表达均有严格的组织特异性和时序性。microRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。

目前研究microRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技术以及第二代测序技术。基于第二代测序技术的microRNA测序，可以一次获得数百万条microRNA序列，能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的micoRNA及其表达差异，为研究microRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。

二、 miRNA测序技术特点 

1.高灵敏度：理论上可以检测单个细胞中一个拷贝的microRNA； 
2.高精度：可以检测microRNA单个碱基的差异； 
3.不受先验信息的干扰，既能鉴定已知microRNA，又有能力发现新的microRNA； 
4.保留定向信息，用于链特异的表达分析； 
5.利用Barcode在单次运行中经济地分析多个样品。

三、 miRNA测序实验技术路线

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图 miRNA-Seq实验流程

四、 miRNA测序数据分析技术路线

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目前研究microRNA表达量的方法主要是realtime-PCR和生物芯片技术，这些方法主要关注microRNA的表达与定量，局限于那些序列信息已知的microRNA，无法发现和研究未知的microRNA分子。

随着第二代测序技术的发展，这一问题得到了解决。基于第二代测序技术的microRNA测序，可以一次性获得数百万条microRNA序列，从而帮助广大科研工作者进行miRNA表达谱水平研究，并预测未知的microRNA。 

研究流程示例

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1. 样本间microRNA表达差异的筛选

MicroRNA的表达量计算使用RPKM法进行归一化（Mortazavi等2008），参照Audic等1997年发表在Genome Research 上的数字化基因表达谱差异基因检测方法，对差异检验的p value作多重假设检验校正，通过FDR来决定p value的阈值。

通常以FDR≤0.01 且存在2倍以上表达差异作为判断基因表达差异显著的阈值。也可以选取更小的FDR阈值和更大的倍数差异，FDR值越小、倍数差异越大，则越有把握说明该基因在两个样本中的表达存在差异。

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2. 差异microRNA表达模式聚类分析 

可以对组间差异表达的microRNA与样本进行聚类分析后绘制热图。用以研究每个microRNA在不同样本间的表达情况，同时也可对样本的分组情况进行验证。 

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图 对筛选的差异基因的进行聚类分析

3. 靶基因预测 

利用TargetScan数据库关联microRNA的靶基因（http://www.targetscan.org），结果形式包含microRNA 和靶基因的相关信息。

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图 对microRNA 进行靶基因预测的结果表格

4. GO功能显著性富集分析（靶基因）

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图 microRNA靶基因进行Gene Ontology 显著性富集

5. pathway显著性富集分析（靶基因）

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图 microRNA靶基因进行pathway显著性富集分析 

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