糖苷酶在多糖化学中的地位很重要。我做过糖苷酶合成多糖的功能测定，还努力建设多糖测定的质谱测试平台。在生物化学教学中，这些经历对提高教学质量大有帮助。
糖苷酶即糖苷水解酶(Glycoside hydrolases,
GH,
EC3.2.1)，是一类水解糖苷键(glycosidic
bonds)的酶，在生物体糖和糖缀合物的水解与合成过程中扮演着重要角色。糖苷酶在催化糖苷反应时，如果水分子的氧原子进攻受体葡萄糖上的异头碳，即发生水解反应，但如果是葡萄糖羟基上的氧原子进攻受体葡萄糖上的异头碳，即发生转糖基反应（合成多糖！）。
糖苷酶几乎存在于所有的生物体中，是一类以内切或外切方式水解各种含糖化合物(包括单糖苷、寡糖、多糖、皂甙和糖蛋白等)中的糖苷键，生成单糖、寡糖或糖复合物的酶。糖苷酶在寡糖合成、烷基糖苷和芳香基糖苷的合成、氨基酸和多肽的糖基化，以及抗生素的糖基化方面发挥了重要作用。
随着采用广泛的生物材料进行酶的提纯和性质研究的进展，已知在生物体中存在着许多种类的糖苷酶，利用这些酶的特异的水解作用，已作为研究糖苷、寡糖、多糖的必不可少的试剂。另外对这些酶的分布、存在形态、形式结构、遗传缺陷的研究，具体地阐明了这些酶在生物体内的正常代谢中所起的作用。糖苷酶一般对糖苷配基的特异性比对糖残基的特异性差，因此有许多仍未能确定其“真正的天然底物”到底是什么。现在常根据糖残基的性质（包括糖苷键的性质）来进行命名和分类的（如α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶），另也常使用历史上最初发现时来自底物名的惯用名（如蔗糖酶=β-果糖苷酶，麦芽糖酶=α-葡糖苷酶）。
糖苷酶（EC
3.2.1）隶属于糖基酶（EC 3.2），是水解酶类（EC 3）中的一大类酶。根据不同的分类标准，可以分成不同的类型。
根据底物分类
在糖苷酶家族中，根据水解的底物不同，又可具体分为195种不同类型的酶，每种均有自己的酶学编号（EC
3.2.1.1——EC 3.2.1.195），例如α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）与α-葡萄糖苷酶（EC
3.2.1.20）。 此分类方法中，分类对象只有糖苷酶，每一种编号对应的糖苷酶成员之间的结构可能会有巨大的差异。
根据结构相似性分类
根据进化学分析，许多水解不同底物的糖苷酶是由同一祖先演化而来，因而具有较高的结构与功能相似性。根据结构的差异，可将糖苷酶具体分为135个家族（Glycoside
Hydrolase
family）即GH1——GH135，每个家族内部的成员，彼此具有很高的结构相似度，根据其催化活性中心结构域的结构，又可将这些家族不完全归纳为14个栏（Clan）即GH-A
—— GH-N。 此分类方法中，分类对象除了糖苷酶还包括少量其他种类的酶，同一家族中的成员虽然水解的底物可能不同，但都具有高度相似的结构，彼此间的亲缘关系更为接近。
糖苷酶根据催化作用机制的不同分为两类：构型翻转酶( inverting
en-zymes)和构型保持酶(retaining
enzymes)。构型保持酶在催化糖苷键水解的同时，还具有转糖基活性，即糖苷键合成活性，该性质使其成为糖类合成的重要工具。
糖苷酶研究综述
摘要: 糖苷酶作为维持生物体基本功能的重要酶类之一,在生物催化和转化领
域具有广泛的应用价值, 其性质和功能是现在研究的热点。 通过对该领域最新研究成果调研, 综述了糖苷酶的结构特性、分子构象、分类、催化机理及其在糖基化合物改性中的应用；
以及对糖苷酶的改造、
糖基化合物生物改性以及糖苷酶作用机理的研究方法。
关键词:
糖苷酶 分子构象
作用机理 应用
糖苷酶即糖苷水解酶(
Glycoside hydrolases, GH,EC3. 2. 1), 是一类水解糖苷键( glycosidic bonds)
的酶, 在生物体糖和糖缀合物的水解与合成过程
中扮演着重要角色。 糖苷酶在催化糖苷反应时,
如果水分子的氧原子进攻受体葡 萄糖上的异头碳, 即发生水解反应, 但如果是葡萄糖羟基上的氧原子进攻受体 葡萄糖上的异头碳,
即发生转糖基反应。 对其性质和功能的研究一直是生物学和 糖生物学关注的热点。
目前已知的糖苷酶大约有2
500 多种, 根据序列相似性分 为100 多个家族,
每一个家族的酶具有相同的空间结构和反应机制。
糖苷酶根据
催化作用机制的不同分为两类: 构型翻转酶( inverting enzymes)和构型保持酶 ( reta in ing
enzymes) , 其中,构型保持酶在催化糖苷键水解的同时, 还具有 转糖基活性, 即糖苷键合成活性, 该性质使其成为糖类(
carbohydrate)合成的 重要工具[1]。
糖苷酶几乎存在于所有的生物体中[2]
, 是一类以内切或外切方式水解各种 含糖化合物(包括单糖苷、 寡糖、 多糖、 皂甙和糖蛋白等)中的糖苷键, 生成单糖、
寡糖或糖复合物的酶。 糖基化合物又称糖苷类化合物或配糖体, 是糖或糖的衍生物如氨基糖、
糖醛酸等与另一非糖物质通过糖苷键连接而成的化合物, 其存在形 式主要有单糖、多糖、皂甙类化合物、糖蛋白等。作为自然界中一类重要的化合
物, 在生物、医药、食品等领域均有着广泛的利用价值[3] , 也是继核酸、蛋白
质之后的又一广阔的生命与健康的研究领域。近年来,随着对该类化合物的深入 研究,
许多糖基化合物需要经改性后才能满足人们的要求。
1.糖苷酶的类型及折叠方式
糖苷酶有4
种分类方法: (1) 按底物命名的分类法, 如水解β -D-葡萄糖苷 键的酶称为β -D-葡萄糖苷酶；
(2) 按糖苷酶的作用机制分类法,根据底物异头构
型的保留或反转, 分为保留型和反转型； (3) 按水解位置分类, 分为内切型和外 切型； (4)
按氨基酸序列和三维结构相似性的分类法， 该法能够区分糖苷酶的结
构特征, 显示酶之间的相互进化关系, 同时, 通过结构和功能的比较, 可以获 知糖苷酶的活性中心(
或者功能区) 和维系其三维空间稳定的区域等, 为获取
活性较高、稳定性较好、底物特异性较强等特性优良的糖苷酶提供理论基础，因而,
目前广泛采用该种分类方式。
根据最后一种分类方式, 糖苷酶分为67个家族,
活性结构域的拓扑学构象有3 种, 它们各自有一样的折叠方式和相同的催化活
性氨基酸。 1) 口袋式:
识别糖的非还原末端, 典型的外切酶是此构象,口袋的深度和长度决定于底物和酶结合基团的长度；2) 裂隙式: 开放结构, 随机结合多
聚长链多个糖单位, 一般是内切酶, 如溶菌酶, 淀粉酶等；3) 隧道式: 像纤维 二糖酶是对一个长链纤维素分子进行攻击,
它们的结合部位处于隧道中。
几种常见的糖苷酶：
1）α -甘露糖苷酶：在N-糖基化过程中所涉及的甘露糖
苷酶， 依据它们所催化水解键位的不同主要可分为α -甘露糖苷酶和β
-甘露糖苷 酶。迄今为止, 已克隆的α -甘露糖苷酶cDNA
20多种, 其中来自人类的6种。α 甘露糖苷酶主要存在于内质网、
高尔基体、溶酶体和胞浆其它细胞器中, 功能是 剪接寡糖结构末端不同连接的甘露糖残基, 形成高甘露糖型、复杂型、杂合型的 N-寡糖。
阿拉伯糖苷酶：
2） 半纤维素在自然界中含量之丰富, 仅次于纤维素, 如
在秸秆中半纤维素的含量占其干重的25% -50%。以前主要作为燃料来使用, 使用 效率很低,
因此这几年来开发和利用半纤维素成为研究的一个热点。 但是要把半 纤维素转化成微生物可利用的糖仍然面临着技术方面的挑战, 需要高性能的半
纤维素降解酶。 阿拉伯糖苷酶的最适反应pH
一般小于7。其最适反应温度差异比 较大, 有些从真菌和嗜热细菌中提纯的阿拉伯糖苷酶最适反应温度很高。
该酶还 有木糖糖苷酶的活性,
是一个典型的双功能酶, 具有很高的利用价值。
3）β 木糖苷酶：
-木糖苷酶在自然界中分布广泛,
现已从细菌、放线菌和真菌(包括 β 酵母)等微生物和高等植物中分离得到。 -木糖苷酶是一种外切酶,
主要催化水 β 解木糖苷, 并以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖, 水解产物为木糖。
木聚糖类半纤维素酶解时一般由木聚糖酶从主链内部先作用于 长链木聚糖的糖苷键上, 将木聚糖随机切成不同链长的低聚木糖, 再由β -木糖
苷酶作用于低聚木糖的末端, 将这些短链低聚木糖降解成木糖。
4）β -D-葡萄糖 醛酸苷酶：
-D-葡萄糖醛酸苷酶是一种糖苷类水解酶, 能催化各种类型的β -Dβ 葡萄糖醛酸苷水解,
早在20世纪50年代国外就有学者对来源于动物体和大肠杆 菌的酶做了研究, 之后各国学者在葡萄球菌、 乳酸菌和瘤胃球菌等细菌, 青霉菌、
曲霉菌和酵母菌等真菌, 黄芪、拟南芥、烟草、水稻和玉米等高等植物中检测出 该酶的活性。国内外学者有关β
-D-葡萄糖醛酸苷酶的研究主要集中在肠杆菌科 和哺乳动物中。
5）日本曲霉产β
-呋喃果糖苷酶：β
-呋喃果糖苷酶能催化蔗糖
水解为葡萄糖和果糖, 并且还具有转糖基作用, 能够制取高含量的低聚果糖。 日 本曲霉产β
-呋喃果糖苷酶分子量约为89
kD，pH 在5- 7范围内酶比较稳定, 蔗 糖浓度对β -呋喃果糖苷酶有一定的影响,
反应时间3-4h β -呋喃果糖苷酶的催
化能力比较高。
6）壳三糖苷酶：壳三糖苷酶是一种功能性几丁质酶。几丁质酶
是一类可以水解几丁质的蛋白质, 存在于原核生物和真核生物的多种物种体内, 因其与物种受到外来侵袭后的防御反应以及信号转导等有密切关系,
所以在抵 抗外来病原体, 特别是植物抗真菌病的基因工程中应用广泛。 人类曾被认为是没 有也不能降解几丁质成分的,
因此长期以来几丁质酶均被作为化疗药物, 如抗 真菌药物、抗疟疾药物、杀虫剂等的靶标。
7）耐高温β -甘露糖苷酶：β
-甘露 糖苷酶(
EC 3. 2. 1. 25)是外切酶, 可从β -D-糖苷键连接的甘露寡聚糖的非还 原端切下甘露糖,
在食品、石油、制药等行业有广泛的应用。石油和天然气井开 发的液压破碎过程中, 胶状半乳甘露聚糖需要β -甘露聚糖酶和β
-甘露糖苷酶 的水解来降低粘度。
在制药业中， β -甘露糖苷酶因其转糖苷作用,
已替代化学 方法生产功能性甘露寡糖。
2.糖苷酶作用机制
糖苷水解酶有两种作用机制,
糖苷转化型和糖苷保留型[4]。糖苷转化酶包括 GH26、GH247、GH265、和GH267
家族的糖苷酶,
糖苷转化型水解酶上的活性中心 有两个羧基, 分别充当广义酸和广义碱。 通过单置换机制导致构型翻转来催化水
解反应(图1).
构型保持酶的一对羧基大约相隔0.55
nm，分别作为广义酸碱 (general acid-base)和亲核体(nucleophile)，通过双置换机制保持构型不变来
催化反应，反应第一步是酶的糖基化(glycosylation)，亲核体羧基直接作用于 底物，形成共价键糖基-
酶中间物(glycosyl-enzymeintermediate)，酸碱羧基 先进行酸催化，提供质子，促使底物离去基团(leaving
group)的离去，反应第 二步是酶的去糖基化(deglycosylation)，酸碱羧基再进行碱催化，激活受体分 子，
发生以水为受体的水解反应和以糖为受体的糖苷键合成反应，后者提供了一 条利用糖苷酶合成寡糖的简便途径，但酶催化反应的可逆性，导致了寡糖合成效
率较低[5]。糖苷键上的氧亲核攻击广义酸上的氢, 一个水分子的羟基亲核攻击非 还原端糖基上的C1,
酶上的广义碱亲核攻击这个水分子上的氢, 这样糖基就从 糖链上水解下来,
这种水解方式单糖构型发生了改变(见图1)。
糖苷保留型糖苷酶包括GH21、GH22、GH23、GH226
等家族的多种糖苷酶,
糖 苷保留型水解酶广义酸上的氢被糖苷键上的氧亲核攻击, 酶上的亲核氨基酸攻 击非还原端糖基上的C1, 酶被糖基化,
生成少一个单糖的糖链(见图2)。糖苷水 解酶的广义碱亲核攻击水分子的氢, 水分子的羟基亲核攻击糖基- 酶中间体的 糖基上的C1,
这种水解方式单糖构型没有发生改变, 酶被去糖基化。 如果是水解 酶的广义碱亲核攻击醇羟基的氢, 受体分子被活化, 捕捉糖基-
酶中间体, 发 生糖基转移反应, 受体分子上就多一个糖基, 即得到了合成产物。 在水解与合成
的动态平衡中, 糖苷酶催化的合成反应形成的产物又是糖苷水解酶的作用底物,
被再一次水解, 导致合成产物收率降低。
近年来研究发现，
对构型保持糖苷酶进行基因改造，在酶催化中心亲核体氨
基酸位点用非亲核体氨基酸取代亲核体氨基酸， 就可以获得糖苷合成酶. 这类酶
失去了原有的糖苷键水解活性，但能利用活化的糖基供体如氟代糖(glycosyl fluorides)
进行糖苷键合成反应，寡糖产量大幅度提高。
糖苷合成酶一般遵循
构型翻转酶的作用机制(图3)，作为糖基供体的氟代糖异头体构型与突变前糖苷 酶的天然底物构型相反，
反应时，氟代糖相当于突变前糖苷酶糖基化后形成的糖
基- 酶中间物， 酶催化合成反应的过程与突变前糖苷酶催化的糖基-
酶中间物解 离过程相似， 生成的产物构型与突变前糖苷酶的天然底物构型相同.
糖苷合成酶 由于缺少亲核体氨基酸，合成的寡糖产物不会被酶重新水解，产物大量积累，产 量大幅度提高.
图3.糖苷合成酶作用机理
3糖苷酶在合成糖苷化合物中的应用
由于糖苷酶的底物适应性很强,
且可以利用非活化的糖作为糖基供体, 被广泛
应用于各类糖类化合物的合成。 糖苷酶不仅可以催化形成寡糖,
也可以将直链或 芳香的醇糖基化, 还可以催化多肽、萜类、酚类、生物碱以及抗生素等物质的糖
基化[6]。
3.1 糖苷酶用于寡糖合成
目前糖苷酶的种类逐渐增加,
可以选择不同的糖苷酶催化合成所需的寡糖。
例如糖蛋白N 端连接的三糖的合成, 其中值得注意的一步是以对硝基苯基- N乙酰- β - 甘露糖胺苷为供体, N-
乙酰甘露糖胺为受体, 在甘露糖苷酶(来自Asergillus
oryzeae)的催化作用下, 合成了很难连接的甘露糖苷键, 形成的N 端三糖也是反应中唯一的产物。
Greanggrai
Hommalai等人利用定点突变技术, 把稻米中β - 葡萄糖苷酶(BGlu1)第414
位的谷氨酸换成甘氨酸, 突变为糖苷合 成酶[7]。在反应体系中有亲和试剂存在(如叠氮化钠和甲酸盐)的情况下, 这种 E414G
突变酶以对硝基苯基纤维二糖苷为受体, α -氟代葡萄糖为供体, 催 化合成3- 7 单糖链低聚糖苷。随后的研究表明, 稻米中β -
葡萄糖苷突变酶对 较长的硝基苯寡糖苷有较大的偏爱, 当供体与受体的比值为5∶1 时, 长链寡糖
的产率可以达到70%-80%。
Pamela
Sears在利用糖苷酶合成低聚糖的过程中,
采 用了两种固定化方法,不仅简化了操作难度, 而且酶可以多次利用。 其一,把糖基 受体放在固定相中,
糖苷突变酶和糖基供体放在流动相中, 由于低聚糖是线性 地从还原端开始逐步合成的, 随着酶液在流动相中流动, 直链糖链被不断地加 长,
而不会合成支链糖苷。 其二, 把糖苷酶放在固定相中,
糖基受体吸附于水溶 性的多聚物上, 糖苷突变酶能通过多聚物催化糖苷键的形成, 随着多聚物在流 动相的流动, 直链糖苷不断地被加长,
最后通过聚合物沉降法, 可以得到纯化 的直链三糖和四糖。
3.2 糖苷酶用于烷基糖苷和芳香基糖苷的合成
烷基糖苷、 苄基糖苷和烯基糖苷不仅是糖化学中重要的中间体, 同时也是一 类可生物降解的非离子表面活性剂,
广泛应用于化妆品、制药、食品和去污剂行 业。酶法合成领域中最著名的英国Vic小组, 以杏仁β -
葡萄糖苷酶为催化剂,
在叔丁醇、 乙腈等体系和无溶剂体系中合成了烷基葡萄糖苷、 烯丙基葡萄糖糖苷、
苄基葡萄糖苷和烯丙基半乳糖糖苷。
3.3 糖苷酶用于氨基酸和多肽的糖基化
β -D-半乳糖(1→3)-α -N-乙酰半乳糖-1-O-丝氨酸衍生物是黏液素糖肽的 核心结构, 化学法合成十分困难,
需要多步的保护和去保护步骤, 而通过化学酶法合成则可使工艺大大简化, 其过程是将α -N- 乙酰半乳糖-1-O- 丝氨酸的
氨基和羧基通过化学法保护后, 在β -1,3-半乳糖苷酶的催化下,
以β - 对硝基 苯酚半乳糖作为糖基供体, 即可合成β - D- 半乳糖(1→3)-α -N- 乙酰半乳糖
-1-O-丝氨酸衍生物。
3.4 糖苷酶用于其他大分子的糖基化
许多有生理活性的大分子都带有糖基, 例如不少抗生素都是糖基化的。 生物 大分子的糖基基团与细胞表面的结合有关,
也与其在体内发挥的作用密切相关。 在糖苷酶的催化下可实现单萜烯糖苷的合成,如将香叶醇、橙花醇和香茅醇等的
糖基化。最近Alcaro等发现利用来自原生菌Sulfolobus solfataricus的β - 糖 苷酶(Ssβ
-Gly)将芴酮酯类物质糖基化，可以增强这类物质的干扰素活性和抗 HSV- 2 活性,
并能降低这类物质的细胞毒性[8]。
4.结束语
综上所述, 糖苷酶在寡糖合成、烷基糖苷和芳香基糖苷的合成、氨基酸和多
肽的糖基化以及抗生素的糖基化方面发挥了重要作用。 随着重组酶生产技术的开 发、DNA 改组技术的不断改进和应用范围的拓展,
以及微生物工程、发酵工程、 生物反应器工程等工程技术的飞速发展, 相信在不久的将来, 人们能够发现并
创造出大量的糖苷酶,
探索开发出更高效的糖基化合物生物改性体系, 以提高 并拓展糖苷酶在糖基化合物改性中的应用价值。
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