THFR1、TNFR2/TNF及信号传导

    1、TNFR与TNF

    TNF受体在多种细胞中调控多种功能如：生长、分化和凋亡。

    TNF受体主要有两种形式的分子。它们都是I类膜蛋白。由于两个不同的配体TNFα、LT－α（lymphotoxine-α）可与两个受体结合，TNF/TNFR系统的生物功能比CD95L/CD95系统（CD95，就是APO-1/Fas，APO-1/Ras为I型跨膜糖蛋白,分子量45KD,属于NGF/TNF受体家族,广泛分布于多种组织中）要复杂的多，同时对前者的了解也少的多。

    TNF-α介导的信号传导，主要通过两个结构不同的受体进行：1型受体（TNFR1，又称作p60，p55，CD120a）和2型受体（TNFR2，又称作p80，p75，CD120b）。两种受体都是跨膜的糖蛋白，膜外N端区域具有多个半胱氨酸丰富的重复序列。虽然这两种受体的膜外部分有结构和功能上的同源性，但细胞膜内部分却完全不同，他们所介导的信号传导通路有所重叠，但也区别明显。

    两个受体膜内部分最主要的区别，在于TNFR1上面有一个死亡结构域，TNFR2上没有，这一死亡结构域是一段约70个氨基酸的序列，这一区域对TNF-α启动的细胞凋亡是必须的。

    与Fas蛋白的死亡结构域相似，这一细胞内的结构域是种附属信号蛋白的结合位点，这些蛋白包括Fas相关死亡区段结合蛋白（FADD），TNFR-1相关死亡区段结合蛋白（TRADD）和TNFR相关因子2（TRAF-2）。

    TRADD和TRAF-2是TNFR1信号传导通路中的分歧点，在这个点上TNFR1的信号的两个方向一个是导致细胞凋亡，另一个是引起炎症的发生，这也是TNFR1信号通路的主要特征。

    TNF在许多细胞和组织中都有表达如：巨噬细胞、单核白细胞、淋巴样细胞和成纤维细胞，在发烧、组织损伤、肿瘤坏死等生理功能中起重要作用。

    TNFR1在绝大多数细胞中都有表达，我们通常认为它在TNF介导的免疫反应中起主要作用，因为TNFR1被敲除的小鼠对内毒素不敏感，并且免疫系统的发育受到影响，所以TNFR1可能参与了免疫系统形成的信号调控。

    TNFR2与TNFR1一样分布广泛，不同之处在于它与可溶形式TNF（sTNF）亲和力较弱，可能主要被膜蛋白形式的TNF（mTNF）激活。另一个不同点在于它的胞内区没有DD，但是它可以直接与TRAF1和TRAF2结合，通过这种方式来传递信号。

    TNFR2结合的配体可以传递给TNFR1加强TNFR1的信号。在TNFR2缺失的大鼠体内，免疫组织发育正常，但是大鼠表现出对TNF诱导凋亡或坏死的抗性，这也说明部分凋亡信号由它介导。

    2、TNF受体介导的信号传导

    在生理情况下，TNFR1的信号传导主要是启动炎症反应通路，并参与休克相关的TNF-α的功能。TNFR1基因缺失的小鼠表现出对内毒素诱导的死亡的拮抗作用，而TNFR2基因缺失的小鼠对此依然敏感。而TNF-α的其它功能则多是与这两个受体同时相关。T细胞介导的肝损伤在不同受体缺失两种的小鼠中都有症状减轻的现象。在膜结合TNF-α过量表达所引起的类风湿关节炎中，TNFR1或者TNFR2的缺失都会使症状缓解。

    所有有核细胞都表达TNF的受体，虽然它们的分布因不同的细胞而有所变化。TNFR1在大部分细胞上是结构性表达的，而TNFR2则是可诱导的。另外，TNFR2只在某些特定的细胞表面表达，并且能区分不同种属的TNF-α分子。虽然两种受体都被认为对TNF-α分子有着很高的特异性和集合力，但是它们集合动力学特征是明显不同的。

    TNF-α的三聚体与TNFR1的结合被认为是不可逆转的，而三聚体和TNFR2的结合却是可逆的，这一点引起了有关TNFR2可能只是一个传递受体的假说的研究，该假说认为TNFR2可能只是起到一个将TNF-α分子传递给TNFR1的作用。然而就TNFR2在T细胞上的功能而言，实际情况可能不是这么简单。

    在没有TNFR1的情况下，TNFR2可以单独启动信号通路来介导TNF-α引起的T细胞激活和分裂增殖。另外，虽然没有死亡区段，在独立于TNFR1的情况下，TNFR2同样可以启动活化的CD8+细胞的凋亡。这些证据表明，起码在T细胞上，TNFR2不仅仅是一个分子传递者的角色，而其功能都因不同细胞而发生变化，并且还与细胞内的一些信号分子的存在与否紧密相关。

    两种TNF的受体都可以被基质金属蛋白酶的成员从细胞表面切除。这些切除反应的发生与炎症信号有关，如TNF-α的结合等。被切下来的受体膜外部分保留了结合TNF-α的能力，并因其浓度和其配体的浓度不同而发挥肌体内部抑制TNF活性或者促进TNF活性的作用。两种受体都可以从尿中完整无缺的排泄出来，实际上，Seckinger等人，Engelmann等人和Olsson等人最早检出的TNF-α结合蛋白，就是这些受体的片断。

     同CD95一样，TNFR胞内区也有一个DD区，DD区由6个α螺旋组成。如果两个蛋白都含有DD，它们可以通过DD相互结合。在结构上DD区与DED（death efector domain）和CARD（caspase recruitment domain）相关。TNF与受体的结合导致TRADD与TNFR的DD结合，TRADD本身也含有DD区。在细胞中如果过量表达TRADD，即使没有TNF诱导，细胞也会发生凋亡，同时激活NF－κB和JNK（jun kinase），这说明TRADD为下游的信号分子提供与受体复合物结合的位点。

    通过TRADD与受体复合物结合的蛋白包括RIP和FADD（Fas associated protein with death domain）。RIP的N端有一个DD区，C端是一个具有激酶活性的结构域。基因敲除实验表明RIP在TNF激活NF－κB的过程中是必需的。FADD的C端有一个DD区，N端则是DED区，它的DED区可以与caspase8前体的DED结合，这对TNFR1和CD95诱导凋亡均具有重要作用。通过这些结合TNFR1也形成如CD95的DISC复合物。然后FADD激活caspase8，再激活下游的caspase，如caspase3。

     FADD的功能在TNFR1和CD95信号通路中的作用基本相同，但是对于RIP则不同。前面我们提到RIP可以与CD95的DD区结合，但是这种结合是没有功能的。在TNFR1信号通路中，它却有重要功能。对RIP被敲除小鼠的细胞进行研究发现，TNF诱导的凋亡在这种细胞中得到了增强，同时TNF激活NF－κB被抑制。RIP具有丝氨酸苏氨酸激酶活性，它可能激活其它的激酶然后磷酸化NF－κB的抑制蛋白IκB。

    另一个参与TNFR1信号传导的DD接头蛋白是RAIDD（RIP associated ICH-1/CED-3-homologuos protein with a death domain）。除了DD区，RAIDD还含有一个CARD区，通过这一区，RAIDD与caspase2前体的CARD区结合，然后激活caspase2。体外实验表明RAIDD过量表达能诱导凋亡。但是这一信号通路有一定的不确定性，因为无论是TNF还是CD95L，均不能诱导FADD或caspase8缺失的细胞发生凋亡，而在这些细胞中RAIDD和caspase2的功能是正常的，同时TNF可以诱导caspase2缺失的细胞发生凋亡，这些现象说明RAIDD，caspase2在TNFR1信号通路中可能并不重要。

    TRAF（TNF receptor associated factors）是指能在TNF受体家族成员之间相互作用的一种蛋白。目前已经发现的TRAF蛋白有六种，TRAF1，TRAF2，TRAF3（CRAF,LAP-1,CD40-bp）TRAF4（CART1），TRAF5和TRAF6。TRAF的C端同源性较高，参与蛋白间相互作用。TRAF2，3，5，6的N端含有一个锌指结构。除了TRAF4，TRAF可以直接或间接与受体结合，间接作用包括通过其它的TRAF相互结合，或者通过TRADD相互结合。

    TNFR2（p75），CD40，CD30和LTβR胞内区都含有保守的TRAF结合结构域，能够直接与TRAF蛋白直接结合。TNFR2可以与TRAF2结合，TRAF2可以与TRADD结合，通过TRADD，TNFR2与TNFR1发生相互作用，从而通过这种间接方式参与胞内信号传导。对TRAF2，3被敲除的小鼠研究表明，TRAF是TNF激活Jun/AP-1所必需的，这也说明TRAF参与了TNFR的信号通路。

    IAP（inhibitor of apoptosis protein）首先在杆状病毒中被发现，它能抑制杆状病毒引起昆虫细胞凋亡。在哺乳动物，两栖动物和酵母中都发现了它的同源蛋白。所有的IAP均有一至三个BIP（baculovirus IAP repeats）重复结构，大多数C端含有锌指结构，部分IAP如MIHC、MIHB还有CARD结构域。MIHC和MIHB可与TRAF1、2结合，参与TNFR信号通路。在培养细胞中过量表达IAP，可以抑制TNF和其它因子引起的细胞凋亡。同时，在哺乳动物细胞中，IAP还可以直接与caspase结合，抑制它们的蛋白酶活性。

    在TNF与受体结合后，NF－κB通常情况下被活化。NF－κB是很多基因的转录因子，它能调控许多转录因子、细胞因子和各种受体的转录。IAP蛋白就是由NF－κB调控转录的。在NF－κB缺失的细胞中，TNF更容易诱导凋亡，而IAP蛋白的过量表达可以保护细胞不被TNF诱导凋亡。这可能解释了NF－κB对细胞凋亡的保护作用。

    TNF同时还能激活Jun/AP-1信号途径，，这一途径是否影响细胞凋亡也不太清楚。

    JNK（Jun-N-terminal-kinase）/SAPK（stress activated kinase）是MAPK信号途径的一部分，它能激活AP－1的转录。在TNF激活Jun/AP-1的过程中，TRAF2参与受体与Jun/AP-1的相互作用，TRAF2如何与Jun/AP-1结合，目前不十分清楚，可能ASK－1（apoptosis stimulating kinase-1）连接了二者。

    在TNF诱导的细胞凋亡中，线粒体也起到了重要作用。TNF同样可以引起PT孔的开放，造成线粒体膜电位的改变和细胞色素C的释放。

    在CD95诱导的凋亡中线粒体起了很重要的作用。首先在凋亡细胞中，Caspase引起线粒体PT（Permeability transition）孔的打开，导致线粒体的跨膜电位下降，同时细胞色素C被释放到胞质中，但是也有报道认为细胞色素C的释放不依赖PT孔。细胞色素C在胞质中可以激活Caspase－9，后者再激活Caspase－3。凋亡抑制蛋白家族的两个主要成员：Bcl-2，Bcl-xl都作用于线粒体从而抑制凋亡。

    Bcl-2首先是在B细胞中被发现的，目前已经发现了多种蛋白属于Bcl-2家族，Bcl-2家族分为两类，一类是抗凋亡的主要有Bcl-2、BclXl、BclW、Mcl-1。一类是促进凋亡的主要包括Bax、Bak、Bad。Bcl家族中的大多数都可以形成同源或异源二聚体，如Bax与Bcl-2可以形成异源二聚体，细胞中Bax和Bcl－2的比例就决定了细胞是否死亡的命运。Bcl－2对线粒体释放的细胞色素C的释放有抑制作用，而细胞色素C对Caspase有激活作用。Bcl－2抑制凋亡的实验中，细胞色素C都没有释放。那么Bcl－2是如何影响线粒体的呢？最近的Bcl－Xl单体的结构和功能研究发现它和可以形成离子通道的一些毒素非常相似。随后的电生理实验表明Bcl－2，Bcl-Xl都可以在人工脂膜上形成离子通道。它们可能通过调节跨膜的电化学梯度而对细胞凋亡进行调节，也可能它们是PT孔的组分，当PT孔打开时引起细胞凋亡。

    研究中发现有两种不同的凋亡信号通路细胞类型I，II。在类型I细胞中，大量的Caspase－8在DISC处被活化然后直接激活Caspase－3。这一步骤不依赖于线粒体的变化。类型II细胞中，只有很少量的Caspase－8被激活，所以凋亡需要线粒体的参与。依赖它激活大量的Caspase－3，Caspase－8，这一过程中细胞色素C起到了重要作用，它可能于Apaf-1结合，Apaf-1是与CED－4同源的人源蛋白，结合后激活Apaf-3（Caspase－9），Apaf-3激活Caspase－3。也只有在II类细胞中，Bcl-2，Bcl-xl的过量表达才能抑制凋亡。它们可以抑制线粒体释放细胞色素C，同时还可能直接与Apaf-1和Caspase－9结合来抑制它们的活化。

    3、TNF的信号转导
    TNF既可在细胞水平直接发挥作用，也可通过和其它细胞因子或效应细胞相互作用而间接地发挥作用。IL-1、IFN-γ和GM-CSF对TNF的生物学作用有明显的增强作用，这可能与增加细胞TNF受体的表达有关。TNF 也能在分子水平通过调节特定的基因表达而发挥作用。这种调节作用主要是通过其特有的信号途径介导的。所以这里着重介绍TNF相关的信号途径。

    实际上目前关于TNF-α在结合到其细胞表面受体上之后介导的大量活性机制尚不十分清楚。两种TNF受体的细胞内结构域与其它受体没有同源顺序（除了TNFR55和Fas抗原），另外也没有什么已知的蛋白激酶催化域。迄今已知道TNF受体可激活好几种信号途径，如：MAP级联反应过程、蛋白激酶C活化以及鞘磷脂酶的活动等。

    当TNF结合到TNFR55时，由于磷脂酶C（PLC）的激活，DAG被迅速从细胞膜磷脂中产生，然后DAG激活两种信号酶：一种是不依赖于Ca的PKC；另一种是酸性SMase。SMase使鞘磷脂更易断裂为神经酰胺，这是一种已知的可刺激多种细胞内响应包括TNF刺激的细胞凋亡的第二信使。TNF-α激活一种中性SMase，它可将膜鞘磷脂水解成神经酰胺，这将进一步导致具有磷酸化MAPK能力的受神经酰胺活化的蛋白激酶的活化。

    MAPK和PKC的激活已被阐明与PLA2的功能状况有关。PLA2对于伴有Leu生成物和前列腺素形成的细胞膜磷脂释放AA是至关重要的，同时与PAF的形成也有关。

    由受体介导的细胞死亡是通过它与细胞内蛋白TRADD（一种含有DD的接头分子）的关联完成的。在TNF与TNFR55结合后，TNFR55可结合于TRADD和FAN。FAN结合在TNFR55的NSD（鞘磷脂酶N区）域，与中性鞘磷脂酶活性有关。TRADD可结合到TNFR55的DD，本身就与FADD、TRAF2及RIP相关。

    其过程是：TRADD的DD募集了TNF依赖过程中的FADD，从而形成了死亡信号复合体，这就使TNFR55和Fas的凋亡途径结合起来。在依赖TNF的途径中，RIP通过和TRADD关联也被募集到TNFR55信号复合体中。RIP是一种Ser/Thr激酶，可参与细胞死亡。尽管RIP过量表达时既和Fas相关，也和TNFR55相关以引起细胞死亡，但是它显然并不是这些信号复合体诱导的细胞凋亡所必需的。相反，它对于TNF通过TNFR55引起的NF-κB的激活倒是必需的。另外，尽管TNFR75没有一个DD，而且通常认为它并不参与细胞凋亡，然而过量表达时它也可以介导细胞凋亡。

    之后，FADD的N端结合到蛋白酶MACH（也称FLICK）上，它被认为是引起细胞凋亡的蛋白酶解级联反应的直接激活物。因此TRADD控制两个不同的途径：细胞凋亡（通过结合FADD和RIP）及NF-κB活化（通过结合TRAF2）。然而，几个报道提示这两种途径从某种程度上讲是相互拮抗的。的确，转录因子NF-κB保护细胞免遭TNF-α引起的细胞凋亡，而且抵御诸如电离辐射和IL-1等的压力。故TNF-α对细胞生长和细胞凋亡的特异性作用可能受NF-κB相对于RIP/FADD的活化量的调节。

    近来运用融合蛋白和二元杂交系统，好几个实验室已分离到可结合于TNFR55和TNFR75的胞浆域的多种蛋白，如近来发现的吸引了广泛兴趣的新的激酶和一些相关蛋白，这使得对TNF信号转导机制的研究也随之有了新的进展。Darnay等描述了一种配体活化了的Ser/Thr蛋白激酶，它与TNFR75的胞浆区有关，这种新的激酶能引起两种TNF受体的磷酸化。另外，Darnay等还描述了一种与TNFR55的胞浆区特异相关的激酶，它可使TNFR55磷酸化（p60-TRAK），而TNFR75的胞浆区并不是它的底物。

    另一种激酶——酪蛋白激酶1（CK-1）则与TNFR75有关。此外，TRAP及上面提到的TRAF、TRADD、RIP都是与TNF信号途径相关的蛋白因子，其中对于TRAF，Rothe等认为存在两种受体相关因子（TRAF1和TRAF2），它们与TNFR75的胞浆区相连（78氨基酸的C端），在那里TRAF2以异源二聚体形式直接与受体相连。

    TRAF2是一种含有N端指环基序结构的蛋白，它能提供直接到细胞核的信号转导途径。通过对这些TNF信号途径中的相关因子的深入研究，可以进一步揭示TNF在分子水平的作用，包括激活或抑制特定基因的转录及其相应的生物学效应。
    文中英文缩写索引：
AA----花生四烯酸; ADCC----依赖于抗体的细胞毒性; 
cIAP----程序死亡抑制剂; CK----酪蛋白激酶; CTL----细胞毒性T淋巴细胞; 
DAG----二酰甘油; DIC----弥漫性血管内凝血; 
EGF----表皮生长因子; 
FADD----Fas相关的死亡域蛋白; FAN----N-SMase活性相关因子; 
GM-CSF----粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;
HIV----人类免疫缺陷病毒; HLA-DR----人类白细胞抗原同向重复(序列）; HTLV----人嗜T淋巴细胞病毒; 
ICAM----胞间粘着分子; IFN----干扰素; IL----白细胞介素; ILP----隔离四肢注射; IRS----反向重复序列; I-TRAF----TRAF抑制剂;
LAK----淋巴因子激活的杀伤细胞; LPS----脂多糖; 
MAF----巨噬细胞活化因子; MAPK----促分裂原活化蛋白激酶; MTD----最大耐受剂量; M-CSF----巨噬细胞集落刺激因子; MHC----主要组织相容性复合体; 
NGFR----神经生长因子受体; NSD----鞘磷脂酶N区;
PAF----血小板活化因子; PKC----蛋白激酶C; PLA2----磷脂酶A2 ; PLC----磷脂酶C; PDGF----血小板衍生生长因子; PMA (= TPA) ----豆蔻酰佛波醇乙酯,十四烷酰佛波醇乙酯; 
RIP----受体作用蛋白; 
SLE----系统性红斑狼疮; SMase----鞘磷脂酶; 
TGF----甲状腺球蛋白因子; TIM---- TNF-α+ IFN-γ+苯丙氨酸氮介; TNFR----TNF受体; TM ---- TNF-α+苯丙氨酸氮介; TNF---- 肿瘤坏死因子; TRAK----TNF受体相关激酶; TRAF---- TNF受体相关因子; TRAP----TNF受体相关蛋白; TRADD----TNFR55相关的致死域蛋白
    TNF与某些疾病的关系
    1、感染性休克
    目前认为革兰氏阴性杆菌或脑膜炎球菌引起的弥漫性血管内凝血、中毒性休克是由于细菌内毒素刺激机体产生过量TNF-α，引起发热，心脏、肾上腺严重损害，呼吸循环衰竭、甚至引起死亡，其TNF水平与病死率正相关。其发病机理可能是TNF刺激内皮细胞，导致炎症、组织损伤和凝血。

    TNF也是急性肝坏死的重要因素。病毒性暴发型肝衰竭外周血细胞诱生TNF，IL-1活性提高，且与病情程度相关。目前有关TNF介导内毒素休克的机理还不很清楚。有人认为TNF能促进前凝血酶原活性物质生成，抑制内皮细胞凝血么调节蛋白的表达，改变凝血功能；还促进吞噬细胞和内皮细胞产生IL-1和白三烯，导致DIC和内毒素休克。TNF抗体（抗血清或单克隆抗体）在小鼠、家兔和狒狒体内均有效地阻止致死性内毒素休克的发生。应用抗TNFMcAb治疗脓毒症和化脓性休克已进入Ⅲ期临床试验，抗TNF嵌合抗体治疗细菌性感染也已开始Ⅰ期临床试验。

    2、引起恶液质
    TNF-α又称恶液素（cachectin），可诱发机体发生恶液质。其特征是肌肉和脂肪细胞衰竭（这是由于TNF使食欲减退，脂蛋白酶合成抑制所致）等。非常高浓度的TNF还可引起心脏血管的变化和代谢紊乱。

    3、与肥胖症中的胰岛素抗性有直接关系
    大量实验证据已证实TNF-α对肥胖期间的胰岛素耐受性有重要作用。可能的机制是其参与了胰岛素的信号过程、介导胰岛素受体阻断的过程等。胰岛素抗性会带来许多病理学问题，如引发糖尿病、引发高脂症、动脉硬化和高血压等。所以对肥胖过程中TNF-α的产生和信号研究将带来肥胖中胰岛素抗性的潜在治疗途径。然而目前尚有许多疑问有待解决：肥胖促发脂肪细胞产生TNF-α的生理成分是什么？TNF-α活动的组织基础是什么？Ser磷酸化的IRS-1抑制胰岛素受体活性的机制是什么？

    鉴于上述弊端，目前许多学者在试图建立新的单独用药方案及联合治疗措施，以降低TNF用量，减少副作用的发生（或程度），达到最佳疗效效果。