从Mechnikov1883年发现吞噬细胞的吞噬现象至今,固有免疫(innate immunity)研究已经历130多年。作为机体免疫系统中执行固有免疫的吞噬细胞和补体分别是1908年和1919年生理学及医学诺贝尔奖的两个奖项。然而,在20世纪中、后叶的免疫学研究的舞台上,细胞免疫和体液免疫一直是两个主角。相比之下,固有免疫应答的研究由于缺乏对其相应受体的系统认识,明显滞后于适应性免疫研究的进程。

    20世纪90年代,Janeway等有关病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)以及识别PAMP的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)概念的提出,标志着固有免疫研究进入了一个崭新的阶段,使固有免疫迅速跟上TCR、BCR、Ig FcR和NK受体等免疫受体(immu-noreceptor)研究的步伐。

    2011年的诺贝尔生理学或医学奖授予了Bruce A．Beutler，Jules A．Hoffmann以及Ralph M．Steinman教授，以奖励他们在天然免疫模式识别受体和树突状细胞研究领域所做出的开创性贡献。宿主的天然免疫系统依赖模式识别受体识别入侵的病原微生物，并通过树突状细胞对其加工处理将抗原提呈给T细胞，从而激活适应性免疫。

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    纪念 Charles Janeway: 今年的诺贝尔生理医学奖感言

    傅新元2011.10.

    传统的生物学和物理学和数学等相比较，更侧重于实验。 生物学工作者常说自己是 bench scientists 或 field scientists. 当我的实验室于1994年搬去耶鲁大学医学院， 听说一个邻居和同事有“理论生物学家”的美誉时，不禁十分好奇。这位不同凡响的科学家就是 Charlie Janeway。

    Charlie 最初是病理系的教授，在我来到之前， 耶鲁大学成立免疫生物学部（Immunobiology Section），他就转去免疫生物学部。 由于我同时在病理系和免疫生物学部任职，从而有较多的机会了解 Charlie 的“理论”。

    众所周知，免疫系统可分为 innate “先天的”和 adaptive “获得性”免疫。当时对获得性免疫系统的分子基础已有相当的了解。例如加拿大籍华人科学家 Tak Wah Mak 发现的T细胞受体，日籍科学家 Susumu Tonegawa揭示的免疫抗体的生成遗传机制 （单独获得1987年诺贝尔生理医学奖）等等。但是对于先天性免疫系统的分子基础几乎没有了解。

     Charlie 在当时提出了一个大胆的猜测和推理：先天性免疫系统应该在进化上比获得性免疫系统更古老，获得性免疫系统可能被先天性免疫系统所调控。更重要的，他提出了一个崭新而又具体的概念：先天性免疫系统的分子基础源于一类“pattern recognition receptors”（模式识别受体）， 从而辨识异体和引发最初的免疫应答。 因此， Charlie的超前的理论也称为 “pattern recognition theory（模式识别理论）”。这是现代生物学历史中，理论和概念成功预测了实验结果的一个实例。

    今年的诺贝尔生理医学奖中的两位获奖者， Jules A Hoffmann 和 Bruce A Beutler 成就在于用试验进而证明了Charles Janeway 模式识别受体的存在和模式识别理论的正确。 值得指出的是， Jules A Hoffmann 最初是在果蝇里发现了模式识别受体 Toll。这第一类发现的模式识别受体被进而称为 “Toll－like receptor， TLR”。 在 Hoffmann 发表的一个权威综述文章里 （ Nature 426, 33-38 ，6 November 2003)， 他引用的第一篇文献就是 Charles Janeway 的一篇综述 (Medzhitov, R. & Janeway, C. Jr Innate immunity. N. Engl. J. Med. 343, 338–344 (2000), 他的实验结果进一步推展了模式识别理论的内涵。

    Charlie 由于他前瞻性的理论贡献，在免疫学界被视作当代免疫学的最有影响力先驱者之一。他不幸于2003年由于脑癌逝世。关于他在和癌症做搏斗中表现的惊人毅力和勇气，将在以后的博文里介绍。

    谨以此文纪念 Charles Janeway。

    附记：Jules A Hoffmann citation: Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, Reichhart JM, Hoffmann JA. The dorsoventral regulatory gene cassette spätzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in drosophila adults. Cell 1996; 86:973-983.

     Charles Janeway的学生Ruslan M Medzhitov，1997 年在人类基因组里发现TLR，并展示此蛋白家族在植物，昆虫和脊椎动物里都有，因此在进化中很古老。 Ruslan 和 Jules A Hoffmann 及 Bruce A Beutler 共同获得2011年的 SHAO PRIZE 邵逸夫生命科学与医学奖.

    模式识别受体为免疫系统细胞表达，是与病原微生物或细胞应激相关的蛋白。可以被模式识别受体识别的微生物特定分子为病原相关分子模式。包括细菌的碳水化合物 (如 脂多糖 和 甘露糖 )；革兰氏阳性菌的肽聚糖和脂磷壁酸，及真菌多糖。根据其功能，模式识别受体可分为细胞内吞噬受体或信号受体。信号受体包括细胞膜连的 Toll样受体及胞浆内NOD样受体。内吞噬受体促进吞噬细胞对微生物的附着，吞噬和破坏，而不传导细胞信号。

    表达在固有免疫细胞上的模式识别受体，是宿主抵抗病原微生物的感应器, 它们能够识别外来微生物的保守成分, 及时向下游传递信号, 引发先天免疫反应。这些模式识别受体不仅相互之间存在cross-talk, 而且会受到其他受体的调节, 从而保证机体对损伤或感染产生适当程度的应答。

    PRR （pattern recognition receptor,模式识别受体），指存在于固有免疫细胞表面的一类能够直接识别结合病原微生物或宿主凋亡细胞表面的某些共有的特定分子结构的受体。

    天然免疫应答是机体防御感染性疾病的一防线，在过去的几十年中曾一度被认为只是免疫系统应答外界刺激的一种低等形式，但随着对免疫系统的深入了解，非特异免疫系统的重要性逐渐为越来越多的人所接受，同时触发了免疫学家对整个免疫系统的功能进行重新审视。在天然免疫中，对于宿主而言最大的挑战就是通过有限的受体，迅速识别大量不同的病原体并作出应答。美国免疫学家Janeway提出了模式识别理论，将天然免疫针对主要靶分子信号称作病原相关的分子模式（Pathogen-associated molecular pattern,PAMP）；相对应的识别受体称为模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）。

    人们曾经设想，由于病原体不断地进化，突变，会使识别的有效性逐步减弱，但对Toll蛋白样受体（TLR）及PAMP的发现则彻底改变了这一看法。PAMP主要是指广泛存在于病原体细胞表面的分子标志，如酵母细胞壁上的甘露糖，以及脂多糖、多肽糖、胞壁酸等各种细菌的细胞壁成分等，它们在进化中趋于保守。TLRs是一类PRR，一组与天然免疫密切相关的受体家族，该家族与果蝇的Toll蛋白家族在结构上有高度同源性。TLR通过识别不同病原体的PAMP在抗感染天然免疫中发挥重要作用。TLR可对PAMP 进行识别，引发的信号传导能导致炎症介质的释放，在天然免疫防御中起重要作用，并最终激活获得性免疫系统。因此有人认为TLR控制着由天然免疫向获得性免疫的转变。
    PAMP的一个重要特点是，它是对病原体生存极为根本的结构，因而极为保守，能满足这一条件的PAMP可能并不多，通过胚系编码的有限个基因就能完成有效识别。PAMP是很多微生物共有的一种保守分子模式，它可以被天然免疫中TLR家族成员所识别。

    TLR家族到目前为止共发现有10类受体，其中对由Janeway等人在1997年发现的TLR4分子的研究最为深入和全面。TLR4蛋白的研究被《科学观察》（Science Watch）杂志列为2001年十大生物科学重要进展之一。

    TLR在结构上包括胞外区富含亮氨酸的重复序列和胞内区的与Toll及白细胞介素（IL）-1同源的TIR结构域（Toll/IL-1 receptor homologous region,TIR）和相似的信号传导分子，即MyD 98、IL-1相关蛋白激酶（IRAK）和肿瘤坏死因子受体活化因子6（TRAF6）。近来又发现的一种TLR4胞桨区接头分子TIRAP可有助于解释MyD 88非依赖的信号传导途径。由于每个TLR相关的信号通路可能不是完全相同的，这导致了各自不同生物学功能的发挥。不同TLR可以在一定程度上识别并区分不同类型的病原体。

    研究表明，TLR4可识别细菌的脂多糖（LPS），TLR2识别肽聚糖等成分，TLR9识别细菌CpG DNA,TLR5识别鞭毛蛋白，TLR3识别双链RNA（dsRNA）。

    TLR4多分布在巨噬细胞、B/T淋巴细胞及脾脏、肝脏、肺脏及胎盘等组织中，主要识别革兰氏阴性细菌表面的LPS。随着对TLR4的分子结构、识别受体、信号传导途径及基因缺陷型动物模型等研究深入，TLR4在机体免疫系统中的重要性也日益得以认识。

    LPS是革兰氏阴性菌外膜成分。LPS首先与血清的LPS结合蛋白（LPS-binding protein,LBP）结合，然后再结合于细胞表面的CD14分子。CD14通过GPI锚定于细胞膜。LPS以LPS－LBP-CD14三体复合物形式活化TLR4信号传导。同时结合于TLR4胞外区的MD-2对LPS信号传导也有重要作用。TLR4是在人类发现的第一个Toll相关蛋白，其信号转导可以通过核因子кB(NF-кB)激活细胞因子基因转录，如IL-1、IL-6和IL-8，介导B7家族成员表达活化，进而通过APC而活化Ｔ细胞。

    研究表明不同LPS成分的结构会影响与TLR4分子的相互作用，而且这种影响存在物种上的差别，提示LPS是与TLR4直接作用的，同时也表明TLR4基因在进化中产生突变而使相对高等的生物获得了更为精确的识别能力，这与某些研究者观察到的TLR4基因存在多态性的结果相印证，也为我们研究生物进化对免疫系统的影响提供了新的理论依据。

     TLR4分子由胞外区、穿膜区及胞内区三部分组成。胞外区富含亮氨酸，可与CD14分子中的亮氨酸重复序列结合而介导蛋白质之间的相互作用。胞内区存在一段序列保守区，该序列与IL-1受体的胞内区的保守序列有高度同源性，被称之为TIR。因此，TLR4分子也属于IL-1受体超家族的成员。TIR区域是TLR4与其下游蛋白激酶相互作用的关键部位。Irina Smirnova等通过对不同种属生物TLR4基因的序列分析，揭示了TLR4分子存在多态性且胞外区变化明显高于胞内区；大约有10％的人类TLR4分子中含有共12种稀有氨基酸，提示TLR4分子在进化过程发生了选择，而进化选择的结果对物种的疾病易感性的影响也是我们将要深入探讨的一个问题。

    越来越多的研究表明，TLR4除了可以识别LPS，还识别其他配体。Shmuel Shohum研究小组揭示了一种真菌表面的多聚糖（GXM）可以经TLR4和CD14识别来激活NF-кB的转录，但却不导致TNF-α的释放。另有研究表明，血管外的纤维素原可以经TLR4途径，促使巨噬细胞释放趋化因子来富集T细胞、中性粒细胞和巨噬细胞；此外，热休克蛋白、呼吸道合胞病毒等均可被TLR4识别。由此可见，TLR4在非特异性免疫中可广泛识别配体，既可针对入侵的病原体，也可识别改变的自身成分，充分显示了TLR4在识别危险信号并诱发机体免疫反应中的重要性。

    众多研究结果表明，TLR4对配体的识别需要其他蛋白的协同作用，目前认识较多的是CD14和MD-2分子。CD14以GPI锚定在巨噬细胞表面或以分泌性蛋白的形式存在，是LPS的高亲和力受体，但缺乏信号传导功能。与之相反，作为LPS的低亲和力受体的TLR4却可以传导刺激信号。二者结合即可形成具备高亲和力结合和信号传导功能的受体复合体。MD-2是晚近发现的一个可溶性蛋白分子，通过与TLR4结合来提高TLR4对LPS的敏感性，并可增加TLR4受体的稳定性。

    TLR信号传导通路

    TLR4广泛表达在各种淋巴细胞表面，其中既包括非特异性免疫细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞，又包括介导特异性免疫反应的Ｔ淋巴细胞和Ｂ淋巴细胞。它识别的配体既有细菌表面成分，又有病毒和真菌的胞壁结构。深入研究TLR4相关的配体识别、信号传导、免疫因子活化等各个环节为进一步认识免疫系统的结构与功能提供了新视角，并为研究疾病发生机制、宿主对疾病的易感性等问题提出了新的启迪；如Ozlem Equils等人晚近报道了有关细菌LPS通过TLR4途径活化HIV的研究，为探讨AIDS的病变机制提供了新的理论依据。

    7年前，著名的理论免疫学家Matzinger提出了免疫识别的危险模式理论，认为诱发机体免疫应答的关键因素是机体细胞受损后产生危险信号。因而不论是自体因素发生改变，还是外界因素产生影响，只要出现供机体识别危险信号就可以诱发效应细胞的活化。机体在进化过程中产生了诸多机制以识别危险信号，如巨噬细胞经TLR受体介导识别PAMPs及某些改变的自身成分；T细胞经MHC方式识别抗原；Ｂ细胞释放抗体中和抗原等。综上所述，TLR作为连接天然免疫与特异性免疫的关键环节发挥着极为重要的作用。因此，重新把目光投向TLR及天然免疫，必然会对免疫学的认识与发展产生深远的影响，甚至为新型疫苗和免疫调节剂的研发均可提供新的重要理论依据。

    Toll样受体（Toll-like receptors, TLR）是参与非特异性免疫（天然免疫）的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLR是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。

    早在19世纪人们了解到微生物致病的概念后，就想到多细胞生物体中应该存在这样的分子，它们能够识别微生物特有的分子，从而识别入侵的微生物。早在100多年前，人们就开始寻找这样的分子。德国著名细菌学家科赫的弟子理查德菲佛(Richard Pfeiffe)创造了”内毒素“一词来称呼革兰氏阴性细菌中能够造成动物发热和休克的一种成分。后来人们发现这种物质是大多数革兰氏阴性细菌产生的脂多糖(LPS）。人们又发现，另外一些分子，如细菌脂肽、鞭毛蛋白、非甲基化DNA等，能够激发宿主的保护性应答，但是如果这样的应答持续过久或者强度过大，就会造成伤害。于是人们从逻辑上推定机体中必定存在这样的分子的受体，它们可以向机体发出存在感染的警报。然而时隔多年人们却没有找到这样的受体。

    1980年，Nusslein-Volhard等在研究果蝇胚胎发育过程中发现有一个基因决定着果蝇的背腹侧分化，将其命名为Toll基因。1988年，Hashimoto等人发现Toll基因编码一种跨膜蛋白质，并阐明了Toll蛋白的结构。1991年，Gay等人发现，Toll蛋白在结构上与哺乳动物中一种天然免疫功能分子——白细胞介素受体1 （IL-1）具有同源性：二者的细胞质部分相似。这第一次提示了人们Toll可能和免疫有关。

    1994年，Nomura等人首先报道了人中的Toll样受体。然而当时Toll的免疫学功能没有得到阐明，所以人们仍然认为Toll样受体是和哺乳动物的发育有关的。不过，两年之后的1996年，Jules A. Hoffmann和他的同事们发现Toll在果蝇对真菌感染的免疫中起着重要作用，从而确立了Toll的免疫学意义。

    翌年，Charles Janeway和Ruslan Medzhitov阐明了一种Toll样受体（后来被命名为TLR4）能够激活与适应性免疫有关的基因。Bruce A. Beutle随后发现TLR4能够探测LPS的存在。后来他们又发现，如果使小鼠中的TLR4突变而丧失功能，小鼠不会对LPS起反应。

    后来，科学家们用基因打靶的方式使其他各种TLR丧失功能进行了研究。结果人们认为，每种TLR可识别不同的一类分子。

    自此，人们不但揭示了Toll样受体在免疫学上的意义，也揭开了100多年前人们寻找的那个谜底。

    所有Toll样受体同源分子都是Ⅰ型跨膜蛋白，可分为胞膜外区，胞浆区和跨膜区三部分。

    Toll样受体胞膜外区主要行使识别受体及与其他辅助受体(co-receptor)结合形成受体复合物的功能。Toll样受体的胞浆区与IL-1R家族成员胞浆区高度同源(IL-1R介导的信号传导系统和机制与果蝇类似)，该区称为Toll-IL-1受体结构域(Toll-IL-1 receptor domain，TIR结构域)。TIR具有嗜同性相互作用(homophilic interaction)，藉此来募集下游含有TIR的信号分子，组成信号复合体。

    但是二者胞外部分不相关，TLR胞膜外区为有17个～31个亮氨酸富集的重复序列(Leucine rich repeats，LRRs)，并且都含有3个胞外段辅助蛋白即MD-1、MD-2和RP105，参与对疾病相关分子模式（PAMP）的识别；而IL-1R为Ig样的结构，在哺乳动物中，一些胞浆蛋白也存在TIR域，如2种信号接受蛋白，MyD88和TIR域的接受子蛋白(TIR domain-containing adaptor protein，TIRAP)，二者在TIR信号传导中起作用。

    目前，在哺乳动物及人类中已经发现的人TIRs家族成员有11个。其中了解比较清楚的有TIR2，TIR4，TIR5和TIR9。人的TLRs家族基因定位分别是定(TLR1,2,3,6,10)4号染色体，9号染色体(TLR4),1号染色体(TLR5),3号染色体(TLR9)，x号染色体(TLR7,8)。

    根据TLRs细胞分布特征，可将其分为普遍存在型(TLR1)、限制存在型(TLR2、TLR4、TLR5)及特异存在型(TLR3)3类。

    根据染色体的位置、基因结构和氨基酸序列，人的TLRs受体可以分为5个亚科，即TLR2， TLR3， TLR4，TLR5和TLR9。TLR2亚科有TLR1， TLR2， TLR6和TLR10；TLR9亚科有TLR7， TLR8和TLR9；TLR3，TLR4和TLR5各自形成一个亚科。

    TLRs分布的细胞多达20余种，Muzio M 等对TLR1-TLR5表达于人类白细胞的研究中发现，TLR1能在包括单核细胞，多形核细胞，T、B淋巴细胞及NK细胞等多种细胞中表达，TLR2、TLR4、TLR5只在髓源性细胞(如单核巨噬细胞)上表达，而TLR3只特异性表达于树突状细胞(dendritic cells，DC)。

    Toll样受体在获得性免疫中的具有识别作用。机体最强的抗原呈递细胞——树突细胞可表达TLR。借助TLR识别LPS、GpG-DNA、肽聚糖、脂蛋白以及分支杆菌的细胞壁成分等具有PAMP的分子，树突细胞被活化而成熟，提供获得性免疫的共刺激信号。因此TLR是微生物成分引起树突细胞活化的桥梁。

    第二，Toll样受体对获得性免疫应答类型具有调控作用。多数TLRs活化后可以诱导抗微生物防御系统，产生IL-1β、IL-6和TNF以及趋化型细胞因子，从而调节机体Th1和Th2两种方面的平衡。

    具体地说，TLR3、TLR7/TLR8、TLR9在病毒核酸成份的刺激下，诱导机体产生I型干扰素，后者发挥抗病毒免疫作用。TLR2和TLR4激活DC后产生不同的细胞因子和化学激活因子。TLR4主要产生IL-12 p70，IFN-γ介导蛋白(IP-10)及转录IFN-β。TLR2刺激则优先表达IL-8和IL-23 。这些可溶性细胞因子诱导T辅助细胞向有利于杀灭病原的方向分化产生细胞免疫应答或体液免疫应答。尤其是IL-12和IP-10 能够刺激T细胞产生IFN，促使Th细胞分化为Th1细胞。如果缺乏IL-12则分化为Th2细胞。

    另一方面，TLR2优先激活p19的转录。p19是近期才被证明的一种可以和p40形成杂二聚体的蛋白，与IL-12具有相似的作用。TLR4激动剂可刺激大量产生IP-10。IP-10是不同细胞对IFN-γ、微生物成分应答后产生的CXC化学激活因子，可对单核细胞、NK细胞产生化学吸附作用，更重要的是Th1型细胞优先表达IP-10受体CXCR3，但TLR2刺激DC不能表达IP-10。