western blot 中甲醇作用

    PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

    也有人说，蛋白因为与SDS结合带负电，甲醇带正电。膜被甲醇预处理有助于蛋白吸附于膜上。

    电转液中SDS增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中泳动。若不加SDS，蛋白会沉淀在胶上，但SDS过多会影响蛋白与膜的吸附。

    甲醇能使SDS与蛋白分离，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但高浓度的甲醇对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。一般来说甲醇的浓度为20%，但PVDF膜截留marker上交联的小分子颜料的能力很差，可考虑提升甲醇的浓度至25%（它对普通蛋白的转膜影响不太，颜料截留更多）；大蛋白转印可考虑降低甲醇浓度，另外SDS必须添加。

    甲醇的另一个作用是降温，旧的电转液由于电解质的消耗和甲醇的挥发，电转时电流或电压变化更快、温度升高也更快，因此可考虑增加额外的甲醇；这点对半干转缓冲液的意义较大，因为半干转缓冲液消耗很慢，缓冲液放置的时间较久，甲醇挥发比较严重，可临时少量补加。

    western blot转印不成功的原因汇总，本文来自著名的伯乐公司的western blot蛋白印迹使用手册。

    不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决?

    解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率;用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交联;低浓度胶，如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间。

    因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。

 

    PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。

 

    western blot电泳转印不成功的原因主要有一下几点： 

    1、转印时间过短，需要延长转印时间，尤其比较厚的凝胶需要更长的时间。 

    2、电源条件不适当：

   （1）转印开始前要核实电流。在特定的电压下，电流可能很低；如果缓冲液使用不当，导电性会很低，在转印膜上将产生很小的电场强度

   （2）更换缓冲液或着增加电压设定值

   （3）尝试高电场强度转印

   （4）核实电源的最高电流值，如果使用的电源不合适，当电流达到最高限定条件时，还没有到达设定的电压

    3、蛋白转印穿透印迹膜

    如果印迹膜功率条件设定的太高或者转印时间太长，蛋白会穿过印迹膜并转运到滤纸上。

    4、蛋白转印方向相反

    凝胶/印迹膜三明治结构组装顺序相反或者放入时放入相反的电极板间，合适电源线的电极是否接反

    5、检测系统失灵或者灵敏度太低

   （1）加入适当的阴、阳抗原对照试剂，以检测试剂盒的灵敏度

   （2）转印后用考马斯亮蓝或者SYPRO Ruby染色试剂对转印后的凝胶进行全蛋白染色，检测是否转运完全

    6、错误的电荷质量比（非变性转印）

    使用更酸或者更碱性的缓冲液增加转印的效率。蛋白在他们的等电点附件时不能够全部转印，缓冲液的PH值应该比靶蛋白的等电点高或者低2个ph

    7、蛋白在凝胶中有沉淀

    （1）在缓冲液加入少量的SDS，SDS可以提高转印效率，但同时又会引起蛋白与硝酸纤维素印迹膜结合力的下降，以及影响蛋白与抗体的活性

    （2）消除或降低转印缓冲液中乙醇或者甲醇的含量

    8、缓冲液中甲醇抑制蛋白洗脱

    降低甲醇的含量，可以提高蛋白的转印效率，同时也降低了蛋白和硝酸纤维膜的结合力，通常使用量为20%

    9、电源线路故障或者电源使用不当

    检查保险丝，确保电源输出电压和电流与转印的需要符合，检测电源的输出功率

    10、凝胶浓度过低

 

抽滤

    抽滤是一种直接将蛋白质转移到膜上的方法。利用真空使溶解的样品滤过膜，蛋白质吸附到膜上，同时样品中其它成分被真空抽走。另外，也可直接将样品点在膜表面使之干燥。随后可对固定在膜上的蛋白质进行分析。

    点印记和狭缝印记是抽滤方法的两种变型，用多支管装置将样品加到膜上成点状或狭缝图样。这些方法可用于快速定性筛选大量样品或定量分析类似样品，尤其是测试复杂分析中实验参数的适用性。

    另一种抽滤方法的变型是格栅免疫印迹，这种方法适用于高度平行的样品分析，当样品量及其优先并且不能用常规方法如ELISA进行分析时使用。格栅免疫印迹可用于表征变态反应原-特异性抗体应答，只需最小量的病人血清。

    当准备抽滤印迹膜时，要考虑以下方面：

    去污剂可以抑制蛋白吸附到膜上。用于样品溶解和漂洗的缓冲液所含去污剂不应超过0.05%，并且仅当必要时才能加入。

    样品体积应足以覆盖每个孔中的膜面积，但所含蛋白量不应超过膜的结合能力。

    含较多颗粒的样品可能堵塞膜孔，而高黏度样品将降低流速。所以在结合前先通过预过滤或离心除去颗粒，只将上清加到膜上。而粘性样品要用缓冲液稀释。

    Western印迹

    Western印迹含一系列步骤，包括：

(1) 用聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。

(2) 将胶上的蛋白转移到膜上。

(3) 鉴定膜上特定蛋白。

    下面将从理论和实践方面讨论Western印迹方法。

    用1-D或2-D凝胶分离复杂蛋白质混合物

    印迹前分离复杂蛋白质混合物的最常见方法是一维(1-D)SDS-PAGE电泳，它根据蛋白质的分子量进行分离。有时用非变性电泳分离天然蛋白质。尽管这种方法通常缺乏变性电泳的分辨率，但当蛋白须保留生物活性时非常有用。

    二维(2-D)凝胶电泳用于分析细胞、组织、和体液蛋白质的组成，是现代蛋白质组学的关键技术。2-D免疫印迹可提供分子量和等电点信息，并可用于区分翻译后修饰产生的不同蛋白质形式。有些情况下只进行1-D电泳分离也可用免疫印迹对蛋白分型。

    分子量标准

    在凝胶中加入分子量标准或标记物可以在电泳分离后估计感兴趣蛋白质的大小。有两种类型的分子量标准：未染色和预染色。未染色分子量标准通常由天然或重组的纯化蛋白混合物组成。在凝胶或膜上显示其位置需要染色步骤。预染标准允许在电泳过程中监测蛋白分离，也可以在随后的印迹步骤中指示转移效率。然而，它们比较昂贵且加入染料会影响蛋白迁移率。预染标准在确定分子量时可能不够精确，并且蛋白质上附加的染料在转移时会影响它们吸附到膜上的能力。

    聚丙烯酰胺浓度

    凝胶中聚丙烯酰胺浓度可以是均一浓度或是梯度浓度。最常见的聚丙烯酰胺浓度为10%，最适合分离10-150KD范围内的蛋白质。若要分析未知蛋白或许要更宽的分离范围，推荐使用梯度胶。例如：4-12%Tris-glycine凝胶适合于30-200KD蛋白质的分离，而10-20%凝胶则能成功地分离6-15KD的蛋白质。SDS-PAGE凝胶通常为1.0到1.5mm厚;但蛋白转印最好使用更薄的胶。

    凝胶电泳缓冲液

    最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-甘氨酸或Tris-tricine组成。缓冲液可以包含0.1%去污剂，通常是SDS。Tris-甘氨酸凝胶可用于分离很宽分子量范围(6-200KD)的蛋白质，并可与变性或非变性条件相容。Tris-tricine最适于分离小分子蛋白质(<10KD), 加样之前还需要还原变性。两种缓冲系统都与蛋白质转印PVDF膜兼容。Tris-乙酸缓冲液有时被用来分离大分子蛋白。

    将蛋白质从凝胶转移到膜

    蛋白质从凝胶转移到膜上的过程中同时保持它们的相对位置和分辨率，这被称为印迹。印迹可以以三种不同的方式实现：

    简单扩散：将膜放在凝胶上，同时放一沓干滤纸在膜上，并在滤纸上放置重物以加快扩散过程。这种方法可用于将蛋白质从一块凝胶上转移到多个膜上，同一凝胶可得到几个印迹膜。扩散法的主要缺点是不能定量转移，与电转比较只能转移25-50%的蛋白质。

    真空辅助溶剂流动：用泵的吸力将分离的蛋白质从凝胶转移到膜上，高低分子量的蛋白质都可以用这种方法转移;然而，分子量小于14KD的蛋白质需要用较小孔径的膜(0.2um)，因为它们不易被0.45um膜吸附。很少从聚丙烯酰胺凝胶中真空转印蛋白质，而从琼脂糖中转移核酸则常用此法。

    电洗脱或电转移：最常用的转移方法，与扩散或真空印迹相比，其主要优点是速度和转移更完全。

    电转移方法

    两种常用的电转移方法是湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。

    湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移2-D电泳中常规使用的大胶比较困难。湿转系统一般在恒压条件下进行，转移过程中混合缓冲液保持电流相对恒定。

    半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快(15-45分钟)又好。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干印迹系统因缓冲液较少不适于较长时间转移。对于大2-D胶的印迹，半干转移是理想选择。半干印迹仪一般使用恒流条件，转移过程中电压逐渐增加。半干转移系统中，滤纸和膜切成和凝胶相同大小，这样电流必须通过凝胶，否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡。气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”(即非转移区)。

    转移缓冲液

    转移缓冲液提供电极之间的电连接，必须能够导电。同时它也提供一种化学环境保证蛋白溶解，而不需担心蛋白质在转移过程中不能吸附到膜上。常规配方可满足多数蛋白样品的需要。多数缓冲液在转移过程中产生热量。针对此原因，很多湿转装置配备嵌入式冷却线圈。湿转也可在冷室中进行，缓冲液使用前可预冷。半干转移中电极板起到散热器功能。但它们的散热能力有限，一般半干转移不能进行太长时间。

    传统转移缓冲液由缓冲系统和甲醇组成。Towbin缓冲液，一种Tris-甘氨酸缓冲液，常用于湿转系统。该缓冲液PH为8.3，比大多数蛋白质的等电点(pI)要高。蛋白质带净负电荷并向阳极迁移。因为缓冲液在槽中混合，转移过程中离子分布相对稳定。

    半干系统使用三缓冲液系统。使用三种缓冲液是因为转移是等速电泳过程，蛋白质在前导离子和尾随离子之间迁移。三种缓冲液是：

    阳极缓冲液Ⅰ：0.3M Tris, PH 10.4

    阳极缓冲液Ⅱ：25mM Tris, PH 10.4

    阴极缓冲液：25mM Tris, 40mM ε-氨基乙酸，PH 9.4

    阳极缓冲液Ⅰ中和阳极板表面产生的过量质子。阳极缓冲液Ⅱ含与阳极缓冲液Ⅰ相同的PH,但Tris浓度降低到25mM。阴极缓冲液含ε-氨基乙酸，转移过程中作为尾随离子，随着蛋白穿透凝胶迁移到阳极不断被消耗掉。通常不推荐用单缓冲液代替三缓冲液系统。单缓冲系统中整个凝胶转移有不一致的趋势，且经常转移不彻底。

    尽管上述缓冲液系统适用于大多数蛋白转移，文献中还有很多适于不同应用的变化类型。最明显的变化之一是推荐10mM CAPS缓冲液(PH 11)用于蛋白质测序。在使用Edman化学法进行自动蛋白质测序时，Towbin缓冲液以及凝胶电泳缓冲液中的甘氨酸会引起高背景。改变缓冲液成分可以显著降低这种影响。对缓冲强度和组成的任何修饰都应非常注意，确保转移装置不会过热。

    准备蛋白质鉴定膜

    干燥

    转移完成以后，在继续染色或免疫检测程序之前应将PVDF膜完全干燥。干燥可提高蛋白吸附到PVDF聚合物上的能力，有助于降低随后分析过程中的解吸。印迹膜干燥后就变得不透明了，这种光学变化是一种表面现象，可以掩盖截留在深部孔中的水分，应按照推荐时间干燥印迹膜，以确保所有液体从膜的孔结构中蒸发出来。蛋白转移后干燥的PVDF膜可长时间保存，这对膜没有不利影响(4℃可保存2周，-20℃可保存2个月，-70℃可保存更长时间)。然而，在非控制条件下长期保存可能使有些蛋白对化学变化(如氧化、脱酰胺、水解)敏感。推荐在低温下长期保存。一旦干燥后，在进行任何分析之前，应将膜在100%甲醇中浸泡润湿。

    蛋白质显像

    染色

    染色是显示印迹膜上蛋白质的一种简单方法。染色可用于：验证蛋白质已经转移到膜上，确定各泳道加样量是否相等

    评价整体转移效率，尤其是使用新缓冲液系统或蛋白样品时。有多种染料可以使用，如有机染料(丽春红、酰胺黑、坚牢绿、考马斯亮蓝)，荧光染料(荧光胺、香豆素)和胶体微粒(金、银、铜、铁或印度黑墨汁)。这些染料可分为可逆和不可逆染料。通常不可逆染料的灵敏度最佳，但它干扰或无法对蛋白进行进一步分析。不可逆染料的实例有酰胺黑和考马斯亮蓝。可逆染料尽管灵敏度较低，但它允许评估印迹膜后从膜上将其洗除。最常用的可逆蛋白染料是立春红。如果靶蛋白丰度太低，则无法用染色法检测到，但对于较高丰度蛋白，染色法通常可以体现蛋白的转移情况。

    用于印迹膜的新荧光染料高度灵敏且可与下游免疫检测、Edman测序和质谱相容。在用显色、荧光或化学发光法进行免疫检测之前，可使用Sypro Ruby和Sypro Rose蛋白印迹染料(分子探针)，它们的灵敏度可达约12ng/带。

    下表列出检测Western印迹膜上蛋白时最常用的染料：

    Western印迹常用染料及其特性检测试剂 大致灵敏度(蛋白/点) 可逆性(与免疫检测的相容性)

丽春红S 5ug 是

坚牢绿FC 5ug 是

CPTS 1ug 是

Sypro Ruby 1-2ug 是

Sypro Ruse 1-2ug 是

酰胺黑 10B 1ug 否

考马斯亮蓝 R-250 500ng 否

印度黑墨汁 100ng 否

胶体金 4ng 否

    透视

    透视是一种专用于PVDF膜的显像方法，它首先应用于Immobilon-P转印膜。该方法基于一种假设，即转移蛋白覆盖的PVDF膜部分能在20% 甲醇中润湿，而周围未结合蛋白的PVDF膜区域则不能。PVDF膜润湿的部分变得可透光，可用背光显示蛋白带并拍照存档。

 

    在发明蛋白质印迹法（Western Blot）出现了30多年之后，这项技术仍然是获取特定蛋白可靠鉴定的关键。许多近期涌现的产品利用各种方法来提高蛋白质印迹实验的可重复性、敏感性、定量性以及速度。

    有三个人都被认为发展了蛋白质的免疫印迹方法，但其中只有一人才算得上是“Western Blotting（蛋白质印迹法）”的命名者，他就是当时在西雅图哈钦森癌症研究中心Bob Nowinski实验室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting（Edwin Southern在1975年发明的一项技术，使用胶、尼龙膜和吸水纸去鉴定一个复杂个体中特定的DNA序列）、Northern Blotting（随后发明出的相似策略，用于鉴定RNA）以及位于西海岸（West Coast）的Nowinski实验室三者之意。

    Burnette的技术成果直到1981年才得以发表。他回想起来，当时审稿人“特别”反对使用“Western blotting”这一名称。但尽管如此，这个名称还是沿袭了下来，而且蛋白质印迹技术也成为了最广泛使用的免疫化学技术之一。

工作原理

    蛋白质印迹法的第一步涉及到用凝胶电泳（Gelelectrophoresis）按照大小分离蛋白质，然后通过将膜置于胶上，将蛋白质转移到膜上（通常是硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜），并在膜上加上若干片吸水纸，然后将这套堆层放在缓冲溶液中，这样就能通过毛细管作用将蛋白质向上拉拽到膜上。这也就是所谓的湿法或槽式转印法。

    另外两项技术是干法和半干转印法，这两种方法比传统的湿转印法更快也更规整，但是对于高分子量蛋白质而言，效率更低。对于半干转印方法来说，膜和胶放置在被缓冲液浸泡过的滤纸层之间，将这些都夹在阴极和阳极之间，电流就能驱动蛋白质转移到膜上。三种方法中，干法转印最快，但转印效率也最低。

    转印结束后，膜被放在稀释过的蛋白质溶液中用来封闭非特异性的蛋白质结合。然后将膜与一抗进行孵育、洗脱，再与标记了信号检测探针的二抗进行孵育。

    最后一步是检测，通常采用化学发光或者荧光方法。在化学发光检测中，与酶交联的二抗能够与检测抗原产生光发生反应，可以被胶片或成像装置捕获。而在荧光检测中，抗体探针被荧光集团所标记。

    荧光检测方法的主要优势在于，它可以同时检测多个蛋白质，并且其信号更加一致。因此与化学发光检测相比，也更有利于量化研究。

    不少制造蛋白质印迹相关设备、软件和消耗品的公司正在努力推动其中一些或所有步骤的自动化，期望能够将这一实验变得更加简单有效。同时在实验中加入了一些验证点，让研究人员能够随时监测实验进展，甚至重新打造整个过程。科学家们寻求的是高效性、稳健性和策略化，从而能够帮助他们避免浪费宝贵的造价高昂的抗体。

    加速免疫检测过程

    转印、抗体孵育、上样和洗脱步骤占据了蛋白质印迹法实验80%的时间，EMD Millipore公司“蛋白质印迹法解决方案”产品经理Michele Hatler这样介绍。

    这家总部位于加州泰梅库拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白质检测系统加速了整个过程，使用真空装置通过膜推入试剂，而不仅仅依赖于扩散作用。这样就能将免疫检测的时间从4小时缩短到30分钟，Hatler表示。她解释说：“我们真正致力于提高蛋白质印迹工作流程的效率。我们仍然是按照传统的步骤走，只是加了一个真空装置。”

    Hatler指出，2.0版本是于2012年9月推出的，相比之前的版本有几个方面的优势。它可以使用中等大小的凝胶（8.5×13.5厘米）和迷你凝胶（7.5×8.4厘米），之前则只能用迷你凝胶。

    “这一设备很便宜，操作也很简便，但切实提高了实验效率，节省了实验时间。” Hatler说。

    伯乐公司（Bio-Rad）的Trans-Blot Turbo蛋白质转移系统是实验台面大小的仪器，能够提供快速而高效的转印。得益于新的转印缓冲液配方，特殊的过滤材料和增强的电流强度（由一个集成电源调节），这一系统能够在短至3分钟的时间内完成转印，并且印迹结果能与槽式转移相媲美。传统的半干转移系统需要15到60分钟时间，而且通常无法提供高分子量蛋白质转移的有力结果。

    增加验证点以缓解忧虑

    蛋白质印迹法的高失败率常常令人感到非常沮丧，尤其是你需要若干天来换取一个结果。“这是一项非常不稳定的技术，”伯乐公司“蛋白质印迹组”市场经理Ryan Short说，“我们对用户调查时发现，一半的用户报告他们用此技术的失败率至少是25%。”

    Short还说：“几乎没有什么机会可以检查实验过程是否满足期望。由此就产生了焦虑。我们正在引入可视验证点的概念来增加信心和确定性。”

    这家公司的标准和Mini-PROTEAN免染色预制胶，利用其ChemiDoc MP胶成像系统，使得研究者可以快速观测到他们的蛋白是否正确地载入到凝胶上，进而确证高质量的蛋白质转移，便于决定是否应该转向下一个步流程或是重新开始。ChemiDoc MP系统是为化学发光和多元荧光斑点成像技术所设计，能够在个人电脑上用ImageLab软件来操作。

    这些验证点“真的很有用”，在实验室使用该系统的加州大学戴维斯分校助理教授Aldrin Gomes表示：“我们可以成像这些免染的凝胶，不用加入额外的染料，而且能够快速判断跑在胶上的样品是否出现问题。我们还能在蛋白质转膜之后再去对凝胶成像，如果其中任何一个步骤出现问题，我们都可以在这一点上停止实验进程。”

    成像和软件提高定量性

    当许多科学家仍在使用胶片分析蛋白质印迹时，世面上开始出现越来越多的宽范围免胶片凝胶记录成像系统，这些系统可以用来成像并分析化学发光的印迹、荧光的印迹斑点或者同时检测这两种印迹。许多公司开始纷纷努力，争相制造尽可能便捷的成像仪及其分析软件。很多公司提供了按键式成像捕捉系统，其大小可在实验台上操作。

    Syngene公司于2012年4月推出了非常简洁的一键操作系统PXi，分析化学发光和荧光印迹。该系统是基于该公司的G:BOX成像系统，并配有GeneSys成像软件。

    2012年10月，赛默飞世尔公司（Thermo Fisher Scientific）推出了myECL成像仪，使用紫外和可见光透射法，专业的滤镜和电荷耦合器件（CCD）摄影技术去捕获和分析蛋白质印迹以及蛋白和核酸凝胶。

    CCD照相机的灵敏度比X射线胶片高两倍，据该公司介绍，该仪器的动态范围高达10倍。用户只需简单地按下触摸屏上其中一个最优预设按钮，无需调焦或调节照相机的设置。用户也可以设置定制曝光，并可同时设置多达5个不同的曝光，或者使用预设的曝光参数。这台成像仪占用的仪器空间很小，可以在实验台上使用。

    Aplegen公司的Omega Lum G凝胶记录系统也具有自动聚焦的特点，可以在实验台上操作，并配备了一台整合的平板电脑。UVP公司在2012年1月推出了Chemi-Doc-It TS2成像仪，其特色在于整合的电脑和触摸屏，允许用户调节曝光、光圈、放大缩小和焦距等参数，当用户按下实时预览（Live Preview）按钮时，还能提供图像实例。

    LI-COR公司最新的红外成像系统版本是Odyssey CLx，该版本具有超过6对数的动态范围，而前一个版本只具有超过4对数的动态范围。当对蛋白质印迹结果进行解析时，这一增大的范围能消除饱和度，提供了更宽的线性范围可以转换为定量数据。

    “研究者在他们的印迹中不仅不会达到饱和，而且他们还可以将多重印迹结果放进成像仪中，根本无须担心为这些印迹进行不同的设置调整。”位于林肯市的Nebraska公司高级产品市场经理Jeff Harford解释说。

    Rehana Leak是位于匹兹堡的美国迪尤肯大学（Duquesne University）的助理教授，她使用LI-COR的Odyssey CLx系统进行细胞如何适应低水平胁迫的研究。“Odyssey成像仪的优势在于它是16位的成像仪，并且具有700和800纳米两个红外波长，一次能够成像两个斑点。” Leak说，“这意味着我们可以一起检测磷酸化和全部构象的蛋白。”两个蛋白亚型通过其他方法很难进行同步区分，因为它们的基团非常相似。

    Leak指出，Odyssey成像仪能够可视化216个红外线信号暗影，与之相比，X射线胶片只能灰度的呈现150个暗影。“这将从150个跃迁到65000个红外暗影，因此这种方法可以获取更高的分辨率。”她接着说，“这是不同寻常的定量化。”

    2012年12月，LI-COR公布了一套新的数字成像系统，即C-DiGit系统，能够用于化学发光印迹。该系统将于2013年推出。“就像最近这些年数码照相机取代胶片相机一样，我们认为C-DiGit系统必将替代胶片化学发光。” LI-COR资深科学家Jon Anderson说，“这项技术能提供胶片用户所习惯的所有灵敏度和图像质量，同时显著提升了数字图像的质量。”

    软件始终保持直观

    传统的软件分析蛋白质印迹时需要用户从图像向电子表格导出数据，而后续的均一化计算和分析都由手动完成。BioRad于2012年9月发布的Image Lab 4.1软件，针对看家蛋白或总上样蛋白提供嵌入式、自动化的均一化。

    “这是目前我在市面上见到的最好的产品之一。”Gomes说，他正在研究蛋白酶体和肌钙蛋白在心脏和骨骼肌组织中的作用。“最好的一点是，它是完全免费的。”Image Lab 4.1软件比他之前在实验室用过的图像分析软件都要简便，Gomes接着说，几乎每个人都能掌握。“这的确增强了我们定量蛋白质的方法。”

    LI-COR公司也已经推出了新的成像软件——Image Studio，能与其Odyssey系统一起使用。用户只需选择一个检测通道，然后按一个按钮就能获得一张图像。这个软件的新版本提供毫米间隔的分析，而不是厘米间隔的，同时又能够执行完全的自动和手动分析。

    重新打造蛋白质印迹

    除了对传统的蛋白质印迹技术进行微调，ProteinSimple公司的Simple Western系统对其进行了重新开发，用毛细管电泳使整个过程完全自动化。在2011年，该公司推出了Simon，计划使用该仪器全面取代蛋白质印迹法。Simon能够基于大小进行分离、免疫检测、洗涤、化学发光检测和定量分析。科学家们仅需要加上样品，然后离开，稍后回来就能得到完全分析好的数据。Simon甚至能够发出蜂鸣声告知用户结果出来了。

    该公司紧接着在2012年初推出了Sally，该仪器允许用户在一次实验中进行96个Simple Western。而最新的设备则是2012年9月推出的Peggy，能够一次分析96个样品，并能按照尺寸或电荷分离蛋白。Simple Western克服了传统蛋白质印迹法中手动部分的缺陷，比方说缺少重复性或定量化结果。此外，在传统蛋白质印迹法中，多重检测已经成为一种挑战。研究者现在可以利用荧光去观测一个样品中的2个或3个蛋白质，转移的设备可以一次同时跑8块迷你胶或4块中等大小的胶，但这已经是传统蛋白质印迹法所能达到的极限。Simple Western能够在每个毛细管中多重分析蛋白质，从而在本质上消除传统蛋白质印迹法的限制。

    对于斯坦福大学医学院的肿瘤学教师Alice Fan来说，Simple Western技术最令人兴奋的事情在于它分析显微级别样品的能力。

    Fan收集病人组织样本的时间已经超过10年，她一直在等待那个能够让她分析肿瘤细胞蛋白质组的工具，而且还无需用去整个样品。“我找寻了多年，希望有一个设备能够用极少量的组织进行蛋白质印迹。”她解释说。

除了帮助她保存之前储存的组织之外，Sally还让Fan可以使用细针穿刺法多次从病人身体中提取一些样本，而不是做全面的活体检视。Fan希望，这将能够帮助她实时观测病人的肿瘤对药物产生的反应。“在描述不同类型的肿瘤方面，这真的对我的研究大有裨益。这是巨大的进步。”

    默克公司（Merck & Co）疫苗生物化学团队负责人Richard Rustandi在2011年底购入了一台Simon仪器。当时，他并没有抱有很高的期待。但是，他说，他得到了意外的惊喜。“这台仪器太棒了，我们在几个月后又买了一台。”

据Rustandi介绍，尽管Simon并不是完美无瑕的，但它能够真正实现定量化。他接着说，手动的蛋白质印迹法通常具有35%到45%的变异率，但他和他的实验室能够将Simon的变异率控制在10%以下。

    随着蛋白质印迹技术地不断演化，研究者最终不用像保姆一样，花费大量的时间照看着他们的实验。“他们的时间非常重要。” Simple Western的产品经理Peter Fung认为，“你的时间利用率越高，就越能做出好的研究。”

本文译者之一高大海，系中国科学院海洋研究所助理研究员

原文检索：

Anne Harding. Not Your PI's Western Blot. Science, 1 March 2013; DOI: 10.1126/science.opms.p1300073

《浙江大学》 2007年

网络状结构PVDF微孔膜的制备及蛋白质转印

邢力  

【摘要】： 本文以聚偏氟乙烯(PVDF)为膜材料，分别通过干法和浸没沉淀法制备得到新型网络状结构微孔膜。

该PVDF膜由于其独特的无皮层和网络状孔径结构，具有极强的蛋白质吸附能力，可以作为蛋白质转印膜。

    在干法制膜方面，以N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)作为溶剂，考察了成膜环境温度和湿度对膜结构的影响。在45℃和相对湿度(RH)为90％的情况下，能够得到无表面皮层的网络状结构膜；蒸发气氛中溶剂组分的增加能够进一步消除背面皮层结构。以上实验表明成膜过程中固化作用是通过凝胶和结晶的竞争机制而实现。进一步考察添加剂对成膜结构的影响，最终以LiCl作为添加剂制得高蛋白吸附量PVDF膜，吸附量达到150μg·cm~(-2)。

    在湿法制膜方面，采用两步凝胶浴法制备PVDF膜，研究了多种成膜条件对膜结构与性能的影响。以磷酸三乙酯(TEP)为溶剂，所成膜断面指状孔消失，形成网络状孔。PVDF的分子量对成膜过程中结晶存在很大影响，相对于低分子量PVDF而言，高分子量PVDF更易产生球状结晶。预蒸发易产生致密皮层结构，不适合制备转印膜。第一凝胶浴中，随TEP浓度的增加，表面致密层逐渐消失：而随反应时间的延长，平均孔径逐渐增大。SEM和XRD结论表明，两个凝胶浴温度的降低都能减小孔隙率，并使成膜晶型从α晶型转化为以β晶型为主的结晶结构，提高了蛋白质吸附能力。证明了液液分相对最终所成膜结构结构起决定性作用，而固化作用则改变结晶度和晶型。对添加剂而言，与TEP相溶性较好的添加剂成膜孔隙率大，并且得到了网络状结构膜，蛋白质的吸附量更大。

    对成膜进行了蛋白质电泳转印测试，转印主要条带清晰，与美国Millipore公司商品膜转印结果相比较，产品相似；表明所制PVDF微孔膜具有着良好的转印效果。

 

 

    正常的蛋白转移，图象是这样的。为了证明转移的实现，用考马斯亮蓝G250染色后，进行转移。并且在凝胶的二面都放了PVDF膜（国产的，不贵！）

    凝胶

    PVDF膜

    凝胶

    PVDF膜

    电泳缓冲液PH在6左右的转移结果，阳极膜是负着色。

    凝胶

    PVDF膜

    同一个电泳槽里的另一个凝胶

    阳极的PVDF膜也是负着色

    这二张膜的转移效果是比较正常的。阳极有蛋白，阴极没有蛋白。这个组沿用了上午的电泳缓冲液，PH在6左右。

    这个电泳槽，换了新配的电泳缓冲液，PH在8左右。

    下图的第一张膜,阳极这一面,与凝胶是左右颠倒的,表现为有蛋白转移,但转移效果不好。
    下图的第二张膜,阴极这一面,与凝胶是一致的,可以看见有蛋白的地方是白色的,无蛋白的地方,是有背景色的，说明在150V，大概150mA时，PH8.0，染料带负电荷，向阴极这一面跑，导致阴极这一面的膜有负染色效果。

    这是和上一个组，使用同一转移槽的另一个结果。

    负染色，按照推理，出现在阴极膜上。