第三章 蛋白质结构与功能-通道蛋白

  

第一节 载体蛋白和通道蛋白

    细胞膜上存在两类主要的转运蛋白，即载体蛋白(carrier protein)和通道蛋白(channel protein)。

载体蛋白又称载体(carrier)、通透酶(permease)和转运器(transporter)，能够与特定溶质结合，通过改变自身的构象，将与它结合的溶质转移到膜的另一侧。载体蛋白有的需要能量驱动，如各类ATP驱动的离子泵；有的则不需要能量，以扩散的方式运输物质，如缬氨酶素。

    通道蛋白是一类横跨质膜，能使适宜大小的分子和带电荷的分子通过简单的自由扩散运动，从质膜的一侧转运到另一侧。

    通道蛋白可以是单体蛋白，也可以是多亚基组成的蛋白，它们都是通过疏水的氨基酸残基进行重排，形成水性通道。

    通道蛋白介导的物质转运其特点是：

（1）选择性  大多数离子通道对离子具有选择性，所以在细胞膜上存在有各种不同的通道蛋白，一种离子通道往往只允许一种或少数几种离子通过，已经发现，钙通道也允许镁、锰和钡离子通过，钾通道则允许少量钠离子通过；

（2）饱和性  离子通道开放后，运输速度在一定范围内随离子浓度提高、内外离子浓度梯度的加大而不断加快，但是超过一定浓度后，速率不再增加。

（3）可控制性  离子通道的开放和关闭受到严格的控制。

（4）通道蛋白参与的只是被动运输。

（5）通道蛋白的运输速度很快，每秒钟可有10 000 000个离子通过。

根据其转运物质的不同，分为离子通道蛋白(ion channel protein)和水通道蛋白（aquaporin）。

 

1.1 离子通道蛋白

    离子通道，根据其开放或关闭的机制可分为三类：电压门控（voltage-gated）离子通道、配体门控(ligand-gated)离子通道、机械门控(mechanosensitive)离子通道。

 

1.2 水通道蛋白

    水通道蛋白能够让水分子自由通过（不必结合），但是不允许其它离子或是其它分子（包括蛋白质）通过。

 

第二节 细胞膜通道蛋白的研究历史

 

    1890年，德国科学家Wilhelm Ostwald就根据人造胶体膜的实验结果，提出生物活组织中测到的电信号，可能是由于离子通过细胞膜的移动形成的。他也因此获得了1909年的诺贝尔化学奖。

    1902年，Bernstein根据当时的电离和电化学概念提出了经典的膜学说，他认为细胞膜两侧带电离子的不同分布和运动是产生生物电的基础。

    基于细胞膜上分别存在电压门控的Na⁺和K⁺通道的观点，神经细胞动作电位产生的详细模型相继出现。此外还有实验证明钾离子是排成单行通过细胞膜的，进一步支持膜镶嵌的通道结构的观点。

    几乎与此同时，Katz和Fatt等证实了神经肌肉接头后膜存在的一类离子通道可受神经递质乙酰胆碱（Ach）而非膜电位的调节。随后，谷氨酸、甘氨酸和5-羟色胺等众多离子通道受体被相继发现和验证，拓展了配体门控型离子通道的研究领域。

    膜片钳技术。

    90年代中期，对P-loop离子通道进行的研究，已经清楚地将通道分子中的选择性滤器定位于细胞外的一端，而通道的门控区则分设于细胞内的一端。

    80年代中期，Peter Agre在研究红细胞膜Rh血型抗原时分离纯化了一个分子量约28kD的膜内在蛋白，命名为CHIP28(channel-forming integral protein，通道形成整合蛋白)。通过对该蛋白进行氨基末端测序及后续的分子克隆研究，获得了CHIP28的cDNA全序列。通过非洲爪蟾卵表达CHIP28，非洲爪蟾卵置于低渗透压缓冲液中使卵细胞体积迅速膨大。将纯化的CHIP28重建于脂质体(liposomes)膜上，并将其置于低渗环境中也同样观察到体积膨大的现象。两种情况下的体积膨大都可被已知能够阻断红细胞水通透性的汞化合物抑制。

    水通道蛋白（现命名为Aquaporin,AQP）在整个生物界，从单细胞到复杂的人体，都广泛存在。

 

第三节 电压门控离子通道的结构与功能

 

3.1. 电压门控离子通道

    电压门控离子通道（voltage-gated ion channel），又称电压依赖性（voltage dependent）或电压敏感性（voltage sensitive）离子通道，因膜电位变化而开启和关闭，膜两侧的跨膜电位的改变，是控制此类通道开放与关闭的直接因素。

    电压门控通道一般包括钠通道、钙通道、钾通道和氯通道型，各型又分若干亚型。

 

3.2. 电压门控钠离子通道

    电压门控钠通道和钙通道的功能性亚基均各由4个疏水重复结构域（Ⅰ—Ⅳ）组成，每个结构域有6段由疏水性氨基酸组成的跨膜α螺旋序列片段（S1—S6），在S5和S6之间尚有一个P段(pore-forming segment)，它从膜外面进入膜中，但不穿膜而中途折返，回到膜外。每个结构域中的第四个跨膜α螺旋在氨基酸序列上均有一个共同的特点，即每隔两个疏水氨基酸间重现一个带正电的Arg/Lys残基。它们与电压门控钠通道的开合机理有关。

 

3.3. 电压门控钾离子通道

 

    电压门控钾离子通道分子只相当于电压门控钠通道和钙通道功能性亚基中的一个重复结构域，经6次穿膜（S1—S6）。S5与S6之间由一个相当于钠通道的P段的H5段连接，整个通道由4个同源亚基构成。

    细菌K⁺通道由4个完全相同的亚基组成，每个亚基有2个跨膜α螺旋，这4个亚基围成一个中心孔结构。该孔道胞浆侧入口处富集带负电荷的氨基酸，这样可以吸引阳离子，排斥阴离子，使通道具有阳离子选择性。每个loop上都包含K⁺通道的特征的保守序列：Gly-Tyr-Gly，其中氨基酸残基上的羰基氧原子深入孔道内，沿垂直于膜平面排列，形成K⁺选择性“过滤器”。

    K⁺在溶液中与水分子结合形成水化的K⁺，该水化的K⁺进入孔道后，必须去掉所有的水分子，这样K⁺可以刚好与孔道loop区的4个氧原子相互作用，使能量得到补偿。而对于水化的Na⁺，进入孔道后，由于Na⁺的离子半径小于K⁺，因此，Na⁺不能同时与loop区内的4个氧原子同时作用，这样脱水过程中需要的能量得不到补偿，因此，K⁺只能有选择性地通透K⁺，而不能通透比小的Na⁺。并且特征序列上的4个Tyr残基侧链与孔区螺旋上的Trp残基一起构成了一个芳香族氨基酸层，它们的位置像袖口般地环绕选择性滤嘴。Tyr残基的羟基与Trp残基的氮原子间形成的氢键与广泛存在的范德华力相互作用，如同弹簧般地把孔道撑开并保持在最适的半径，使K⁺安然通过。

    与电压门控阳离子通道相比，电压门控氯离子通道中不仅缺失S4电压感受器，且骨架排列结构也有自己的特征。其呈反平行的二聚体，拥有两个位于中央的狭小孔道呈双倍螺旋对称排列。每个亚基包括18个长短不一的α螺旋均倾斜于膜内，每个亚基的前半部分和后半部分在结构上是相似的，但在膜内的走向相反，构成相互围绕假二倍对称的中间Cl^-通道孔洞。

 

第四节 配体门控离子通道

 

    配体门控离子通道(ligand-gated ion channel)，

    烟碱型乙酰胆碱（nACh）受体

 

4.1  nAChR门控性和特异性的结构基础

 

    nAChR是由4种不同亚单位组成的五聚体跨膜蛋白。nAChR的每个亚基可分为两个结构区域，即胞外区（膜外区）和跨膜区；每个亚单位均由一个大的胞外N端（约210aa），4段α螺旋跨膜序列（M1—M4）以及一个短的胞外C 端组成，其中M2直接面向孔道，围成离子通道，M2呈倾斜状态并在中央发生弯折(kink)，此处有数个疏水氨基酸。每一个亚单位都是一个四次跨膜蛋白，约由500个氨基酸残基构成。膜外区由β折叠构成，其中的两个α亚基上含有乙酰胆碱的结合位点；推测跨膜部分为四条螺旋结构，其中一条螺旋含较多的极性氨基酸，就是由于这个亲水区的存在，使五个亚基共同在膜中形成一个亲水性的通道。亚单位通过氢键等非共价键形成一个结构为α2βγδ的梅花状通道结构， Ach在其受体上有两个结合位点，分别被定位在αγ与αδ的分界面。

    当AChR通道处于关闭状态时，来自5个亚基的M2的中央疏水氨基酸存在侧向相互作用，使得5个M2紧密接触，形成一个牢固的“腰带”壮的“门”。另外3个α螺旋围在M2的外面，将M2与脂双层分割隔开来。在M2与M1及M3的交界处存在缝隙，这些缝隙为M2的运动提供了空间，为通道的门控提供了必要的结构基础。

    在无ACh结合的情况下，由受体各亚基中共同组成的孔区处于关闭状态，此时，亚基上的亮氨酸残基伸向孔内形成一纽扣结构。一旦ACh结合到受体部位，便会引起孔区的构象改变，M2亚基上的亮氨酸残基从孔道旋转出去，其形成的孔径大小足以使终板膜外高浓度的Na⁺内流，同时使膜内高浓度的K⁺外流。结果使得该处膜内外电位差接近于0值，此被定义为终板电位，标志着ACh化学信号跨膜传递的完成以及随之出现的肌细胞兴奋和收缩生理反应。

    与K⁺通道类似，AChR通道的入口存在一些负电荷的氨基酸。由于静电场的作用，正电荷的离子被吸引可进入孔道，负电荷的离子被排斥而不能进入孔道,这就解释了AChR的阳离子选择性；与K⁺通道不同，在AChR通道不存在类似于K⁺通道的选择性过滤器，对K⁺没有选择性。当通道开放时，直径小于0.9nm的水合阳离子都能通过，这就解释了AChR通道是一个非特异的阳离子选择性通道，同时也解释了AChR通道的高效运输能力。

 

第五节 机械门控离子通道

 

    细胞感受摩擦力、压力、牵拉力、重力、剪切力等，并将机械刺激的信号转化为电化学信号，引起细胞反应的过程称为机械信号传导（mechanoransduction）。

    目前比较明确的有两类机械门通道，一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏感的离子通道。前者几乎存在于所有的细胞膜（如：血管内皮细胞、心肌细胞、内耳毛细胞），后者仅发现于内皮细胞和心肌细胞。牵拉敏感的离子通道的特点是对离子的无选择性、无方向性、非线性以及无潜伏期，为2价或1价的阳离子通道，有Na⁺、K⁺、Ca²⁺，以Ca²⁺为主。

 

第六节 水通道蛋白（aquaporin，AQP）

 

    根据这些水通道蛋白功能特性的差异，目前将其分为两个亚家族：

    AQP1、2、4、5、6和AQP0的基因结构类似并且相互之间氨基酸序列具有30%~50%的同源性，且对水的通透性具有高度选择性，成为AQP家族中的水选择性通道亚家族。

    AQP3、7、9和AQP10之间基因结构和核苷酸序列序列相近似，除对水分子通透外，对甘油和尿素等中性小分子也具有通透性，成为AQP家族中的第二个亚家族——水—甘油通道（aquaglyceroporin）。

    AQP8的基因结构与上述两个亚家族都不同，而且对水、甘油和尿素都有通透性，有可能成为第三个亚家族。

 

    水通道蛋白分子的基本结构是一个单肽链，由两个同向重复部分组成，前后两个部分在氨基酸序列上有同源性，包括两个高度保守的天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸（NPA）序列，整个分子形成一个含有6个跨膜域的疏水性内在蛋白。

    AQP1在质膜上以四聚体形式存在。AQP1的四级结构是由4个对称排列、长5nm、直径3nm的圆筒状亚基包绕而成的四聚体。每个单体肽链跨越细胞膜6次，并围绕成腔型，中间可能即是水分子穿越的孔道。已经证明这4个亚基作为水通道的作用都是独立的，但四聚体的结构对于维持单个亚基的位置很重要。AQP1晶体的三维结构为沙漏模式，分子中的两个同向重复序列分别于细胞膜内外两侧组装，并在NPA处折叠形成只容许单一水分子通过的孔道。孔道内部带正电荷的氨基酸残基排斥带正电荷的质子通过。

    另外，蛋白分子内部产生的局部静电场使通道中间的极性发生转换，迫使水分子在通过通道时进行旋转式双极运动，通过通道上半部分时的旋转方向与通过下半部分时的旋转方向相反。这种旋转方向的转换阻止了通道内部形成连续的水合质子网，从而阻断了质子通过“质子逃逸”机制通过水通道。

 

思考题

1、载体蛋白，通道蛋白，水通道蛋白，离子通道蛋白，钾离子通道，配体门控离子通道，机械门控通道，离子通道病

2、试比较载体蛋白和通道蛋白。

3、离子通道主要与哪些疾病有关？

4、试比较钠通道、钙通道和钾通道的结构。

5、谈谈nAChR门控性和特异性的结构基础。

6、水通道蛋白的结构与功能。

7、除了本章涉及的一些重要通道外，生物体内还有哪些通道蛋白存在？请查阅相关文献问答。