2013年南京师范大学“现代生物学实验技术”研究生课程，复习时可以参考以下内容：

 

5．试举例说明生物活性物质两种存在部位与其生物功能关系？

答：存在部位：胞内和胞外。功能：细胞内的生物活性物质有些游离在胞浆中，有些结合于质膜或器膜上，或存在于细胞器内。对于胞内物质的提取要先破碎细胞，对于膜上物质则要选择适当的溶剂使其从膜上溶解下来。

 

7．保存生物材料的主要方法有哪些？何谓“丙酮粉”？其工艺目的是什么？

答：生理活性物质易失活与降解，采集时必须保持材料的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染。如胰脏采摘后要立即速冻，防止胰岛素活力下降。保存生物材料的主要方法有速冻、冻干‘有机溶剂脱水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮于甘油中等。

丙酮粉：其作用是使材料脱水，脱脂，使细胞结构松散，增加了某些物质的稳定性，仃利于提取．同时又减少了体积，便于贮存和运输。而且应用““丙酮粉丙酮粉””提取可以减少提取液的乳化程度及粘度，有利于离心与过滤操作。提取可以减少提取液的乳化程度及粘度，有利于离心与过滤操作。

 

9．叙述生物活性物质的提取过程中活性物质的保存措施。

答：⑴采用缓冲盐系统⑵添加保护剂⑶抑制水解酶的作用⑷其他保护措施（冷、热、酸、碱）

 

10．叙述生物活性物质的溶解规律，及其含义

答：相似相溶。一方面表示溶质与溶剂分子结构上的相似，另一方面表示溶剂与溶质分子间的作用力相同。

 

11．何为“盐溶”作用？生物制药过程中如何利用“盐溶”作用？

答：一些不溶于纯水的球蛋白在稀盐中增加溶解度。这是由于盐离子作用于生物大分子表面，增加了表面电荷，使之极性增强，水合作用增强，促使形成稳定的双电层。

 

12．`冻干工艺主要包括哪些工艺阶段？实际工作中如何完成？

答：冻干工艺主要包括预冻结，升华和再干燥三个阶段。

预冻结：制品的预冻有两种方式：

其一是制品与燥箱同时降温；另一种是待干燥箱搁板降温至-40℃℃左右，再将制左右，再将制制品放入。

升华：使用增压泵

再干燥：板温控制在+30℃左右，并保持恒定。

 

13．如何理解设计分离纯化早期使用方法的选择依据与原则？

答：选择依据：分离纯化的早期，由于提取液中的成分复杂，目的物浓度较稀，与目的物理化性质相似的杂质多，所以不宜选择分辨能力较高的纯化方法。早期分离纯化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有

利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩的作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。

选择原则：从低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大者为合适。

 

 14．常用的中式放大方法和程序是什么？

答：方法有经验放大法，相似放大法，数学模型放大法

程序：采用步步为营或一竿子到底策略

 

20．何为KS盐析法、β盐析法？他们的特点及使用条件？

答：在一定的pH和温度下以改变离子强度(盐浓度)进行盐析，称作Ks盐析法。

特点：往往是向提取液中加入固体中性盐或其饱和溶液，以改变溶液的离子强度(温度及pH基本不变)，使目的物或杂蛋白沉淀析出。

适用范围：多用于提取液的前期分离工作。

β盐析法：在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作β盐析法。

特点：溶质溶解度变化缓慢且变化幅度小，沉淀分辨率比Ks盐析好

适用条件：在分离的后期阶段．为了求得较好的分辨率，或者为了达到结晶的目的，有时应用β盐析法

 

21．在蛋白质盐析时一般常将蛋白质的浓度控制在多少为宜？

答：2%～3%

 

22．在蛋白质盐析时如何控制PH？                     

答：选择蛋白质溶液的pH值于沉淀目的物等电点附近进行盐析

                                                                                                23．如何选择盐析用盐？盐析用盐的浓度何表示？

答：选用盐析用盐要考虑以下几个主要问题：

 (1) 盐析作用要强。(2) 盐析用盐须有足够大的溶解度，且溶解度受温度影响应尽可能地小。(3) 盐析用盐在生物学上是惰性的，最好不引入给分离或测定带来麻烦的杂质。(4) 来源丰富、经济。

盐析用盐的浓度用相对饱和度来表示

 

24．何为分部盐析法？何为重复盐析法？何为反抽提法？

答：分部盐析法：

分部盐析法在盐析应用中是最适用的常规操作法。例如用不断增加盐浓度的方法可以从血浆混合物中分别制取3～5种主要组分蛋白。生产上有时先以较低的盐浓度除去部分杂蛋白，再提高饱和度沉淀目的物。分部盐析也是了解生物高分子或其提取物的溶解度和盐析行为的有效手段。

重复盐析法: 在实际操作中，有时为了避免蛋白浓度过稀造成体积过大，回收率较低的情况发生时，盐析可采用稍高的蛋白质浓度。此时因高蛋白质浓度而发生的共沉淀作用所引起的分辨率不高的缺点,可用重复盐析的方法加以克服。

如在血清γ-球蛋白的制备中多次进行30%～33%硫酸铵饱和度的重复盐析以求得到较高纯度的γ-球蛋白。

反抽提法：在实际制备操作中有时为了排除共沉淀的干扰，先在一定的盐浓度下将目的蛋白夹带一定数量的杂蛋白一同沉淀。然后再将沉淀用较低浓度盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白，达到纯化之目的。

 

25．盐析法完成后，如何除去制品中的盐？

答：透析,凝胶过滤 

 

26．选择变性沉淀法的基本原理？它包括了哪些具体操作？

答：原理：主要是破坏杂质，保存目的物。其原理是利用蛋白质、酶和核酸等生物人分子对某些物理或化学因素敏感性不同，而有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。

操作：(1) 使用选择性变性剂 (2) 选择性热变性 (3) 选择性的酸碱变性

 

27．生物大分子结晶时其条件控制主要包括了哪几个方面？

答：包括：浓度、纯度、pH值、溶剂环境、温度、时间和品种

 

28．何为Jakoby法？它是如何实现蛋白质大分子提纯与结晶的？

答：硫酸铵抽提结晶法：Jakoby法是先用较高浓度硫酸铵将大部分蛋白质沉淀，再以较低浓度的硫酸铵溶液在低温下分步抽提(0℃附近)蛋白质沉淀，然后将抽提液的温度逐渐升至室温，慢慢析出晶体。

在分步抽提中，溶解在高浓度硫酸铵中的蛋白质首先被抽提，然后按各种蛋白质在不同盐浓度下的溶解度差别而彼此分离。

 

30．何为“吸附”？“正吸附”与“负吸附”法有何区别？

答：“吸附”是物质分子在两相界面上浓度的增加。

区别 ：负吸附：用吸附剂吸附提取液中的杂质。

正吸附：吸附提取液中的有效成分。

 

31．预测吸附剂相对吸附量的简单规则有哪些？

答：规律是：吸附物的平衡浓度愈大，吸附量也愈大。

 

32．在实际生产中，脱色、出热源、去除过敏物质或杂蛋白通常采用哪些吸附剂？

答：脱色和除热原一般用活性炭，去过敏物质常用白陶土。

 

33．温度对生物大分子的吸附影响主要有哪些？如何设定吸附法的温度条件？

答：升高温度会使吸附量降低。但在低温时，有些吸附过程往往在短时间达不到平衡，而升高温度会使吸附速度加快，所以会出现温度高时吸附量增加的情况。

对蛋白质或酶类的分子进行吸附时，情况有所不同。有人认为，被吸附的高分子是处于伸展状态的，因此这类吸附是一个吸热过程。在这种情况下，温度升高，会增加吸附量。对高分子物质的吸附，情况很复杂，目前对其基本规律，知道得还不多，在生产中主要靠实践找出适当的条件。生化物质吸附温度的选择，还要考虑它的热稳定性。对酶来说，如果是热不稳定的，一般在0℃左右进行吸附；如果比较稳定，则可在室温操作。

 

34．pH对生物大分子的吸附有哪些主要影响？

答：pH值会影响吸附剂或吸附物解离情况

 

35．何为“针用活性炭”（俗称针炭），其主要用途是什么？用量为多少？

答：针用活性炭是注射液生产中常用的吸附剂，

用途：在水溶液中能吸附一些色素、有味物质、酸、碱、盐和热原等。

用量一般为液体的0.02%～1%

 

36．大网格吸附剂的空隙度和湿真密度的含义是什么？

答：空隙度系指吸附剂中空隙所占的体积百分率。

湿真密度系指空隙充满水时的密度。

 

第六章

37.从离子交换树脂上洗脱目的物的基本方法是什么？

答：(1) 调节洗脱液的pH值，使目的物粒子在此pH下失去电荷，甚至带相反电荷，从而丧失与原离子交换树脂的结合力而被洗脱下来。

(2) 用高浓度的同性离子根据质量作用定律将目的物离子取代下来。对阳离子交换树脂而言，目的物的pK值愈大(愈碱)，将其洗脱下来所需溶液的pH值也愈高。对阴离子交换树脂而言，目的物的pK值愈小，洗脱液之pH值也愈低。

 

38.试述影响离子交换速度的影响因素。

(1)离子向外扩散的速度与半径成反比。树脂粒度大交换速度慢。

(2) 搅拌速度搅拌速度能影响膜扩散速度，与交换速度呈正相关。搅拌速度增大到一定程度后影响渐小。

(3) 树脂交联度交联度大则树脂孔径小，离子运动阻力大，交换速度低。

(4) 离子半径和离子价离子水合半径增大，交换速度下降，离子每增加一个电荷，交换速度下降一个数量级。大分子在树脂中的扩散速度特别慢。

(5) 温度交换体系温度高时由于离子扩散加快，交换速度也加快，但必须考虑到生化物质对温度的稳定性。温度升高25℃，交换速度增加l 倍。

(6) 离子浓度交换体系如是稀溶液，交换速度随离子浓度的上升而加

快。但达到一定浓度后，交换速度不再随浓度上升。交换速度(y)与浓度成正比的范围在0.01N以下。

 

39.为什么在分离蛋白质或酶时较少选用强酸、强碱树脂？

溶液的酸碱度直接决定树脂交换基团及交换离子的解离程度，不但影响树脂的交换容量，对交换的选择性影响也很大。对于强酸、强碱性树脂，溶液pH主要是左右交换离子的解离度，决定它带何种电荷以及电荷量。从而可知它是否被树脂吸附或吸附的强弱。对于弱酸、弱碱性树脂，溶液的pH还是影响树脂解离程度和吸附能力的重要因素。对生物活性分子而言，过强的吸附以及剧烈的洗脱条件会增加变性失活的机会。过强的交换能力有时会影响到交换的选择性，同时增加洗脱的困难。

另外，树脂的解离程度与活性基团的水合程度也有密切关系。水合度高的溶涨度大，选择吸附能力下降。这就是为什么在分离蛋白质或酶时较少选用强酸、强碱树脂的原因。

 

40.试述离子交换法在蛋白分离纯化时,离子强度的选择原则及其原因？

离子种类与电荷基团竞争性反应的序列,预实验。 

 

41.离子交换法操作的主要方式有哪些？

离子交换操作的方式一般分为静态和动态操作两种。

 

55.透析法与超滤的主要不同在于那几方面？

答：透析法的特点是用于分离两类分子量差别较大的物质

 

56.在透析法中保留液”与“渗出液”分别指那部分溶液？

答：透析膜两边都是液体，一边是供试样品液，主要成分是生物大分子，是试验过程中需要留下的部分，被称作“保留液”

另一边是“纯净”溶剂，即水或缓冲液，是供经薄膜扩散出来的小分子物质逗留的空间场所，或是提供平衡小分子物质的“仓库”，透析完成后往往是不要的，被称作“渗出液”

 

57.简述透析膜的基本处理步骤。

答；成胶、刮膜和成膜三个基本步骤

 

58.简述超滤技术在生物制药工艺中的主要应用。

生化制药中，超滤多用于过滤蛋白质、核酸、多糖等生物大分子溶液。

 

59.何为截留分子？

所谓“分子量截留值”是指阻留率达90%以上的最小被截留物质的分子量。

 

60何为浓差极化？

外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，而大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度，这就是所谓“浓差极化”现象。

 

61.微孔滤膜的孔径大小及孔径均一程度，是良好分离效果的保证，检查膜孔径的方法有哪些？

气泡压力法、水流量法、细菌过滤法

 

62.为何在使用微孔滤膜工艺的前后通常要进行“严密性验证”或“气泡-压力验证”？

操作过程中应保持环境清洁，滤膜前后要密封，防止高压差下短路和泄漏，要避免负压时因外界空气进入引起污染。