5 ml 样本 (1.4 mg/ml) 的肌红蛋白（峰 1）、核糖核酸酶 A（峰 2）和细胞色素 c（峰 3）分别以指定的流速在 1 x 13 cm (8.7 ml) 柱上运行。

缓冲液为 20 mM 磷酸钾，pH 值为 8.0，梯度为在 75 ml 内 0–1 M KCI。

 

HD-650离子交换层析检测仪（北京杰瑞恒达科技有限公司）

主要技术参数：

特点：在线检测生物样品随洗脱液中离子强度改变的洗脱峰。节约实验费用，节省摸索实验条件所耗费的大量时间。

检测波长：254nm、280nm(可选配220nm、340nm)

波长精度：±1nm

样品池光程/容积：4mm／80ul(特殊要求另配)

吸光度量程：0.05~4A

电导测量范围：0~200 mS／cm

电导测量精度：±1%F·S

电导电极规格常数：K=1.0(可选配K=0.01,K=0.1,K=10)

层析柱固定架：承重2kg，固定夹开口18mm

通讯方式：COM口／USB口

层析数据显示/存储:双坐标界面,同时显示洗脱峰/线性梯度图谱;

 

作者: liuliancy   收录: 2011-08-24    发布: 2011-08-17

问：

昨天用DEAE-纤维素（阴离子交换树脂，功能基团二乙胺基乙烯，自身带正电荷，反离子是阴离子，亲水性基质是纤维素）过柱子，图谱如1，目标蛋白跟杂蛋白差没分开。

今天用相同的缓冲液相同的上样量和样品，结果却一点都没分开，柱子1*20，上样2ml，梯度洗脱液为50mL 20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，得到的图谱却是2和3的样子，请教各位长辈这是为什么？洗脱液要怎么调节才能将得到较好的洗脱效果？
图1

图2

图3

A答：

1、我没听说过Tris-醋酸这个缓冲液，你有没有试过Tris-盐酸缓冲液？
2、你的两个洗脱液成分，用的是20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，看来你是想用pH梯度和离子强度一起来制造一个洗脱梯度，这样做有什么依据吗？我认为这样会引入误差，因为两个因素制造的梯度可控制性，可能会弱于一个因素。

如果用pH值，不知道稍低的pH值会不会引起蛋白质失活，所以我喜欢用离子强度作为洗脱梯度，起始缓冲液和洗脱缓冲液的pH值相同，但是氯化钠分别为0和1M，能制作出一条从0-1M的连续线性梯度。这样结果也更好分析。
3、两个峰即使是顶点能分开，但交叉很大也是不纯的。DEAE在我的实验里分离效果差，比不上其它的阴离子交换层析柱，如果有别的层析柱，也可以联用。
4、层析柱1*20没有意义，计算柱体积才有意义。

 

问：

感谢老大了！！不过Tris-醋酸我也是第一次听说，一个文献上的洗脱条件，这些东西也都是第一次用，所以有很多不太了解，用Tris-Hcl氯化钠分别为0和1M梯度试试，不知道老大能不能推荐几个阴离子交换层析柱，我做的是SOD（超氧化物歧化酶），再次感谢！！

 

B答：

控制好洗脱梯度和体积，以及PH，当然不要盯着一个柱子。

 

A答：

你方不方便先试一下我说的条件，大概会花一天，再把结果发上来。

 

问：

做了下，分别用20mM tris-乙酸ph7.5和50mM tris-乙酸ph5.0（含NaCl 0.3M）、20mM tris-hcl ph7.5和20mM tris-hcl ph7.5（含NaCl 1M）、20mM tris-hcl ph7.8和20mM tris-hcl ph7.8（含NaCl 0.8M）、20mM tris-hcl ph7.2和20mM tris-hcl ph7.2（含NaCl 0.8M）。图谱如下：
20mM tris-乙酸ph7.5和50mM tris-乙酸ph5.0（含NaCl 0.3M）

图4

20mM tris-hcl ph7.5和20mM tris-hcl ph7.5（含NaCl 1M）

图5

20mM tris-hcl ph7.8和20mM tris-hcl ph7.8（含NaCl 0.8M）

图6

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

20mM tris-hcl ph7.2和20mM tris-hcl ph7.2（含NaCl 0.8M）

图7

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

请指教！

 

A答：

做得很好，我有两个问题：酶活力在哪里；横轴的0是不是开始进入0-100%洗脱梯度，是不是不包括上样和平衡，如果包括，那么洗脱时间是从哪里到哪里？

 

问：

酶活都是第三个峰，前面的两个都是杂质；横轴的0就是直接上好样后进入0-100%梯度洗脱的，把平衡的也算在内了，也就是加样后没平衡直接梯度的，这样不行吗？

 

C答：

最好先做线性洗脱吧~这样子，可以为选择不同的梯度，打好基础。
其实分离效果还是不错的，可能是流速太快。应该试试流速。

 

A答：

你的主要峰大概为三个，但是第一个峰是非常靠近0点，说明有很多弱吸附的蛋白质，这些蛋白质可能会被起始缓冲液冲洗下来，现在你没有平衡步骤，所以有可能会影响吸附得稍微强一些的蛋白质出峰，造成蛋白质的重叠。

假如加入平衡步骤，你的第一个峰可能高度会下降一些，峰形状可能也会有所变化。这仅是分析，由于你的蛋白质在后面出来，所以第一个峰无论怎样都不要紧，所以我认为除非你的蛋白质较前出来才要平衡，现在你不用平衡也可以，虽然得不到本来的峰形状，但没关系。
从图5（20mM tris-hcl ph7.5和20mM tris-hcl ph7.5（含NaCl 1M））看出，你的蛋白质在中间稍前出来，此时的电导率约为35-40%，所以我推测你的蛋白质等电点约为5.0-5.5。
假设你的四次实验的样品上样量一样，那么可以初步从峰的高度来推测所受蛋白质干扰的程度。图4的峰高度最低，推测含有杂质蛋白质最少。与其它峰之间构成的峰谷高度（主要为第二个峰）也能指示蛋白质之间的分离效果，虽然图7最小为0.12，但是峰3过高，说明杂质蛋白质极多；虽然图6较小为0.35，但是峰1过细，难以断定峰1右侧的小峰是否为峰2，而目的蛋白质所在的峰左侧有不平滑处，有可能是峰2，所以可能峰3收到了峰2的干扰；图5中峰形状最好，三个峰之间很明显能分开，分离效果我觉得较好；图4中虽然峰2和3之间分得不开，但峰3的高度是最低的，说明杂质蛋白质可能较少，同时峰2、3之间隐约有个不算太明显的小峰，因为峰2、3的高度较矮，所以可能是属于峰2、3的蛋白质有些被合并到中间去了。
综上所述，我觉得分离效果由好至差可能是4、5、6、7，但是5比4可能稍差而不是差得很明显，建议选用4，5作为备用。同时将四次层析有酶活力的收集管跑SDS-PAGE，依据蛋白质条带来确认分离效果。由于是第一步纯化，可能蛋白质条带较多，但是可能可以推测。

生物学实验一切皆有可能，所以我只说可能。

 

D答：

上样量太多达不到很好的纯化效果吧 1%

 

问：

老大呀！我换了个样品，先用20m Mtris-乙酸 ph7.5，把基线冲平后用20mM tris-乙酸 ph7.5和50mM tris-乙酸 ph5.0（含NaCl 0.3M）梯度洗脱的，怎么才能把这两个峰分开啊？？怎么调节缓冲液，我调了几次，把ph5.0（含NaCl 0.3M）的ph调高点，盐浓度高点可分离效果还不如这个呢，应该怎么调会好点啊？

图8

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A答：

峰的顶点不尖锐有两个可能的原因：
1、含有的蛋白质种类很多，且蛋白质性质极其接近，出峰时紧挨着，导致各个蛋白质峰相互交叉，表现为一个总的线条平缓的峰。
2、层析柱的分辨率太差，且填料不均匀，在填料松散的地方洗脱液很容易就能将蛋白质洗脱下去，但在紧密的地方不容易洗脱，导致本应该出来的蛋白质延后，表现为峰曲线平缓。   
从你这个曲线来看，大致可以分为3个峰，第一个峰为非常平缓的，且顶点高度为第二、三个峰的基线，第2、3两个峰的顶点不尖锐，说明这两个峰各自含有的蛋白质都非常多，说明即使是能把这两个峰分开，蛋白质也是不纯的。两个峰之间的峰谷距离基线极远，说明交叉极其严重，如果不是层析柱的装填质量差，那么无论怎么优化，它们都不能分得开。
DEAE是弱阴，如果强阴可能会分离效果好一些。填料方面，如果有条件，可以试一下Mono Q，强阴，填料硬一些。用DEAE出来一个峰的样品用Mono Q可以分出4个峰。

1

2

图9

B答：

这样的纯化方法太老了，当然我不反对这样做。 换一根柱子或者再加一根柱子就能解决问题了。
另外，强阴或者弱阴离子柱跟分离效果没关系，而是对pH范围的耐受不同来分的。

 

问：

您的意思是换填料或者纯化两遍？那要是不用这种老的方法用什么比较好啊？

 

B答：

如果你要纯化出很纯的酶出来，一种填料如果达不到你的要求，就在此基础上，再用别的填料纯化。我的主要意思是：现在还少在一个柱子或者一种填料上反复试各种条件，除非你是在优化工艺。

 

D答：

注意拉梯度时的柱体积，还有就是如果能够保证回收率，尝试一下稍低一点的pH值，尝试一下直接洗脱，看看纯度