4.
变性样品的离子强度不能太高（I<0.1mM）.调整样品的PH在4.0左右,这对于能否做好非变性样品非常重要.上样BUFFER
中没有SDS之外,加入样品后不能加热.
有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：
blue
native（BN-PAGE），
clear
native（CN-PAGE），
quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。
在一个典型的native
PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开。蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。
1. Blue
Native PAGE
Blue
Native
PAGE是最古老的Native-PAGE技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。
Blue
Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。在Blue
native
PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在
pH7.5条件下也会向阴极迁移。但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。
2. Clear
Native PAGE
Clear
Native
PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。然而，这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。
Clear
Native
PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7）的电泳技术，分辨率通常比BN-PAGE低。迁移距离决定于蛋白的固有电荷和凝胶孔径大小。因此，BN-PAGE比CN-PAGE应用更广泛。然而CN-PAGE在考马斯染料分析天然混合物干扰进一步分析时存在着优势。如测定催化活性（例如线粒体ATP合酶）或分离用于荧光共振能量分析的微量膜蛋白，CN-PAGE比BN-PAGE更温和，特别是使用洋地黄皂苷时，CN-PAGE
可以保持膜蛋白的超分子组合体的结构而BN-PAGE会导致分解。线粒体ATP合酶中的具有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE检出，但BN-PAGE无法检出。
CN-PAGE起源于无色非变性PAGE，是BN-
PAGE之后出现的技术。既然CN-PAGE中没有带电荷的染料，蛋白在电场中的迁移完全取决于这个蛋白的固有电荷。大分子和低聚蛋白必须有合适的物理参数才能在CN-PAGE中分开，特别是PI低于5.4，分辨率低。由此看来，CN-PAGE除了获得未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中没有什么优势了。优点是条件更温和，在蛋白质组学研究中具有更大优势。BN-PAGE和CN-PAGE的缓冲液和电泳条件一致，但是CN-PAGE的阴极缓冲液中不含考马斯染料，而是将0.025%的洋地黄皂苷加入到凝胶中。
3.
QPNC-PAGE
QPNC-PAGE（quantitative preparative native continuous polyacrylamide
gel
electrophoresis）是一种应用于生物化学和生物有机化学的根据等电点分离蛋白的高分辨技术。这种凝胶电泳被生物学家应用于独立活性或天然金属蛋白样品或正确或非正确折叠的可溶性的与金属辅助因子结合的蛋白混合物的鉴定。
3.1电泳缓冲液
QPNC-PAGE是在特殊的装置里进行的分离生物活性分子的电泳过程。在特殊的电泳缓冲系统（基于Tris-HCl和NaN3）中，一个生物系统中的大多数蛋白都会带电荷，在电场的正负极之间迁移。
尽管PH（10.00）的电泳缓冲液并不与细胞或组织中的生理PH相符，但是在生理PH（8.00）的缓冲体系下蛋白会连续洗脱并分成不同的部分。分离系统包括电泳槽和分部收集器，这些装置要置于冰箱中。
3.2凝胶特征
为了得到一个PAGE所需的聚合完全的凝胶，聚丙烯酰胺凝胶需要在室温下凝聚69hr。最后，得到均质的含机械稳定和自由的单体或原子。凝胶的孔径很大，因此分子筛作用在电泳分离中最小化。基于上述原因，凝胶和活性分子之间的相互作用可以忽略。待分离的金属蛋白（如金属分子伴侣，蛋白酶感染性初级因子，金属运输蛋白，淀粉状蛋白，金属酶，金属肽等）不会分解成脱辅蛋白和金属辅助因子。孤立蛋白的生物活性结构（天然或3D构象）在QPNC-PAGE后不会发生构象变化。所以，金属蛋白和蛋白异构体在PAGE中被定量的分成高纯度的部分。QPNC与其它电泳技术如SDS-PAGE，2-DE，等速电泳和CN-
PAGE等相比被称为“突破性的方法”。
3.3
实验方法
（1）储备液
1）200mM
Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00，室温
2）200mM
Tris-HCl 10mM NaN3 PH8.00，室温
3）40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C，4℃（新鲜）
（2）电泳缓冲液
20mM
Tris-HCl 1mMNaN3 PH10.00（除气），4℃
电泳槽上部：500ml电泳缓冲液
电泳槽下部：2000ml电泳缓冲液
（3）洗脱液
20mM
Tris-HCl 1mMNaN3 PH8.00（除气），4℃
洗脱室：700ml洗脱缓冲液
（4）分离胶
丙烯酰胺4%T
体积40ml
成分：
4ml40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C
4ml 200mM
Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00
32 mL
H2O
200 μL
10% APS
20 μL
TEMED
APS和TEMED最后加入。轻轻搅拌烧瓶中的混合物，注意不能产生气泡。然后把溶液移入内径为28mm，长为40mm有刻度的玻璃柱中。加入3ml正丙醇。60分钟聚合后用电泳缓冲液冲洗凝胶，然后用4ml电泳缓冲液覆盖凝胶表面。在室温下凝集69小时。
（5）样品的准备和收集
保持样品（生物液体）温度为4℃。0.3ml甘油和2.7ml样品在分离前混合5分钟。然后把处理好的样品加入到电泳缓冲液的上层。这些蛋白在此电泳缓冲液中不是带负电（PI<10.0）就是带负电（PI>10.0），因此在电场中不是从正极迁移到负极就是从负极迁移到正极。已分离的蛋白分子用特殊的生理洗脱液连续洗脱，并用分部收集器收集。整个分离系统必须在4℃冰箱中进行。
纯化的，半纯化的和未处理的样品都可以用于QPNC。样品分离纯化中应该避免类似于蛋白质沉淀等过程以防止蛋白变性。化学稳定的金属蛋白可以用非变性的凝胶渗透层析来进行进一步纯化。
3.4
定量和鉴定
Fe， Cu，
Zn， Ni， Mo， Pd， Co， Mn， Pt， Cr， Cd和其它金属辅因子可以通过ICP-MS（Inductively
coupled plasma mass
spectroscopy，电感耦合等离子体质谱）来定性和定量。因为PAGE条带的高纯度和选择性凝集，相关的结构可以用非变性条件下的NMR来分析。
3.5
应用
QPNC的应用对象为分子量6-200kDa的酸性、碱性和中性金属蛋白。在测定血液或其它临床样品中独立的金属蛋白结构和功能关系方面具有重要应用，因为不正确的金属陪伴蛋白的折叠。例如超氧化物歧化酶（SOD）的铜陪伴蛋白出现在这些基质中或许预示着神经病变疾病如肌萎侧索硬化病等。QPNC-PAGE，SEC，ICP-MS和NMR等技术的连用可以得到病人或潜在的病人液体基质中相关金属蛋白的生理状态的结构。这一技术可以提高蛋白错折叠相关疾病的诊断和治疗水平。
温和胶，简写为BN-PAGE，由Schägger等建立的一种电泳系统，最初被用来分离牛心脏组织中线粒体上的蛋白质复合体。由于在研究蛋白复合体上的优势，BN-PAGE被用于线粒体膜、类囊体膜、质膜等膜蛋白复合体的研究。
在做植物类囊体膜的电泳时，结合叶绿素的蛋白质复合物呈绿色，而不含叶绿素的呈蓝色，因此又称之为蓝绿温和胶电泳。不要很特殊的仪器，做梯度胶的电泳槽不一样，只要增加一个能灌梯度胶的梯度混合仪和一个恒流泵就可以了。示意图如下：
第一向
双向
在做BN胶时用的bistris和SDS胶用的tris有什么区别？
bistris
tris
从结构式看起来bistris应该比tris的缓冲能力更强,这样更有利于保护复合物的完整性，这是我的理解。我也没有用tris做过bn，不知道效果怎么样。至于你说有些抗体在bn上不好用，不知道你做的什么样品，是不是在sds的时候能有好的结果，而在bn的时候出问题。这个可能是你的蛋白经过bn后量太少了。在抗体的识别上应该没有问题，大家都是经过sds变性的，蛋白都是伸展的结构。
Blue-Native PAGE(BN-PAGE)技术讨论
蓝绿温和胶(BN-PAGE)作为一种很好的电泳技术在蛋白质复合物的分离以及研究蛋白质与蛋白质相互作用中发挥着越来越重要的作用。在蛋白质组学日益发展的今天，越来越多的人用这项技术来研究蛋白质复合物以及亚基。大家可能会遇到各种各样的问题，希望大家能够对这项技术讨论。我做了两年的BN-PAGE，中间有不少弯路，也有一些经验，欢迎和大家交流。
bn后要经过第二向的sds啊,第二向就是一个变性的过程,中间也要经过一步平衡,平衡液里面就有sds,所以那里面说"Some
antibodies do not work in BN-PAGE, i.e. anti-BAP31 and anti-BAP29
antisera, therefore, a second dimension has to be used in these
cases."bn里面做不出western,我想应该就是结构的问题,复合物的存在使一些识别位点包裹在复合物的里面,所以出不了结果,这是单纯只做第一向bn的结果,经过第二向sds就不会有问题了.
请问膜蛋白复合体的分离还有哪些方法？
不知道你说的膜蛋白蛋白质复合物是指什么意思，并没有专门分离膜蛋白复合体的方法啊，一般都是提取膜蛋白，然后从中用bn来分离里面的复合物。就像用分离得到的质膜来做质膜中的蛋白质复合物，用分离得到线粒体来做呼吸链。你说的方法是指用两相法分离质膜，用percoll或者蔗糖密度来分离线粒体吗？这里面可能没有什么可以比较的，大家一般都是用各自的方法来分离不同的亚细胞结构，比如植物组织质膜的话就是两相法，而线粒体是用percoll或者蔗糖密度来分离。最关键的是拿到比较纯的亚细胞组分，这对最后的bn分离还是很重要的。
本人做BN/SDS-PAGE电泳已经两年有余，实验技术掌握得还不错，但是一直没有达到实验目的。我是想通过这个实验方法在细菌中获得合成一种小分子的酶系复合物，已经有很多证据暗示，参与此种小分子合成的几个重要的结构基因应该是一个Complex，有充分的体外和遗传学证据，但是没人从体内得到这个complex。首先我通过WB定位，基本上证实这个复合物是定位在细菌的细胞膜上的，所以我们就采用这个经典的分离膜蛋白复合物的方法去寻找，用的方法大致如下：破碎细胞－高速离心去除细胞碎片－高速上清超速离心（100,000g×2hr）去除上清即水溶性蛋白，留下沉淀（膜蛋白？）－用Buffer重悬沉淀，加入detergent溶膜，超速离心（200,000×
2hr）去除未溶部分，进行BN/SDS-PAGE，一维时，就发现胶的整个泳道smear现象非常严重，所以在二维时，整个胶面的横纹（竖纹较少）很多，而游离的可鉴定的蛋白点很少。其中有四条横纹非常明显，而且恒定出现，为了解决这个横纹问题，尝试了很多方法，均未取得效果。不知道baiy兄弟做BN-PAGE的目的是什么，有没有遇到过这个问题？另外再请教一下，分离膜蛋白用我上述的方法是否得当？现有的资料分离膜蛋白的方法很多，超速离心的离心速度和时间也不是很统一。希望能得到楼主和其他各位同学的建议和帮助。
细菌的膜蛋白提取大约就是你这个方法了，但不知道你提到膜蛋白后是用什么样的buffer来增溶膜蛋白的。一般来说抛开你要的目的蛋白复合物不谈，应该还是能走出细菌膜蛋白复合物的漂亮的bn图。你说实验技术本身掌握的不错，不知道你走什么样的蛋白来说明这个问题的，是不是走其他样品的时候就能得到很好的结果。你说的胶的整个泳道smear现象，可能是样品里面有一些杂质，所以建议你提膜蛋白的时候多洗几次，也就是说用buffer溶好后再进行超离，然后再溶解，加入detergent，只有好的样品才能走好胶。
另外就是有可能你的目的蛋白是复合物，但就是表达量比较少，这样估计也很难得到很好的结果，其实通过co-ip的方法也能说明你要的问题啊。
对于你最后提出的建议，作CO-IP，我已经做个这个实验了，但是因为用的是多克隆抗体，所以得到的免疫共沉淀的结果非常糟糕，条带很多，但是经过WB和取点作MS，没有得到目的蛋白以及可能与目的蛋白形成复合物的任何蛋白，如果想在CO-IP上有所进展的话，可能一是直接制备单抗，二是用抗原来纯化得到的多克隆抗体，以求得到意义上的“单抗”，此工作在进行中。关于膜蛋白的二维电泳，我用其他宿主的膜蛋白（例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）进行BN/SDS-PAGE时，得到的二维电泳效果很好，点分布清晰，利于鉴定（我不会在这上面贴图)。而用我研究的宿主菌（链霉菌），其膜蛋白在二维电泳后，就出现我上个帖子所描述的结果。我溶膜的buffer的大致成分是：50mM
bistris,750mM 6-ACA,1-3% detergent(tritonx-100 or DDM,
SB3-10)。我研究的这个细菌是革兰氏阳性菌，产色素，这是与大肠杆菌和芽孢杆菌的主要两个区别。另外，这个经常出现的四条横纹我已经做过MS鉴定，是蛋白条带，属于多重跨膜的transport蛋白，查阅相关资料，的确是很重要的运载蛋白，参与宿主的初级和次级代谢，所以丰度很高，但是想不通的时，为什么在其他两株菌中，应该存在类似的transport蛋白，但没有出现横纹。等我把这个论坛上贴图的方法掌握了，我会把相应的图贴出来，以便讨论起来更容易和有针对性一些。
链霉菌的话，我想可能是膜蛋白的提取不太好办吧，毕竟和大肠杆菌和枯草芽孢杆菌这样的细菌不太一样。
提取是没什么问题，就是溶膜方法有很多障碍，摸索了很多detergent以及不同detergent的组合，最终找到一种detergent可以把我的目的蛋白复合物溶出。下面的图是BN/SDS-PAGE的结果：右图存在明显四条带，且在不同detergent溶膜，均能在2-D
gel上出现，经鉴定为四个重要的transport。
另外请教一下baiy兄弟，有没有做过BN-PAGE后直接转膜做WB的实验？像这种具有大的complex的胶转膜需要注意些什么事项？我实验室只有湿转的条件。
看起来你应该bn本身走胶应该没有问题了，而且走的比较漂亮。从图上看基本还是样品的问题，也就是说你这种提膜的方法可能还要改进，就是提出的膜里面可能杂质太多，这种杂质就是链霉菌特有的了，而你即使用detergent溶解后还是会把杂质溶进去，然后走样品就会出现问题了。所以你还是再查查链霉菌膜蛋白的提取，毕竟和普通的大肠杆菌和枯草不一样，方便的话你把第一向也贴出来。
bn直接做western我没有做过，但是500kd的native－gel我还是做过的，湿转大约100v2.5h能做出来，所以我想如果很大的比如1000kd可能有问题，但是500kd的都还是能做出来的。
链霉菌手册中有关膜蛋白的提取方法描述较少，从事这方面研究的人也不是很多，所以很多东西都需要自己去摸索。不知道baiy兄弟说的detergent会把杂志溶进去是指的什么方面？我用detergent溶膜后，还要进行超速离心，200,000g×2hr，我想这个速度和时间，不溶的杂质应该差不多全部到沉淀里去了。下图为我跑的BN-PAGE胶。我近期可能会尝试做一下BN后的WB，尽量摸索点经验出来，到时会在这上面公布。
（缩略图，点击图片链接看原图）
因为链霉菌膜蛋白有点特别，所以我说的杂质是指那些按照你的膜蛋白提取方法提取到膜蛋白后，随着膜蛋白一起沉淀下来，也会溶进你的detergent，再超离也下不来，同时会对你的bn产生影响的物质。
嗯，我查下相关文献。
下面的图是转二向后做银染得到的,显影稍微显过了.从我的图上来看,点主要集中在胶的上面部分.也就是说我得到的小分子量的蛋白比较少．二向胶用的是10%的Tricine胶．我想请大家帮我分析一下问题出在哪里．谢谢！
（缩略图，点击图片链接看原图）
baiy wrote:
线粒体蛋白复合物分离文献，还有一些文献太大传不了，要的人pm我email，我发过去
我还要（hot3721@163.com）啊，谢谢啊
已经发了一些，以后要的话pm我，不要在这留邮箱
hot3721 wrote:
我还要（hot3721@163.com）啊，谢谢啊
请问，做Blue-Native
PAGE，buffer都不含有SDS，我的蛋白在14－100DK之间，用什么marker呢？
你的问题好像不是我们这个专题讨论的话题。
你要问的应该是native-page吧，这里讨论的是blue native-page.
你做native－page，应该没有什么marker这一说，只有把你的蛋白跑sds做比较才能知道分子量。
zhaog69 wrote:
请问，做Blue-Native
PAGE，buffer都不含有SDS，我的蛋白在14－100DK之间，用什么marker呢？
baiy大哥，你看我的图出现了下面的胶紧缩这种情况，还有就是上面背景很深，是什么原因造成的阿？还有高分子量的蛋白质marker在什么地方买阿？谢谢！
（缩略图，点击图片链接看原图）
这种紧缩的问题基本是因为你把第一向的胶放入第二向后，然后封胶，如果你用琼脂糖封胶，这样第一向胶左右两头就是琼脂糖，这样整个胶的上下电场强度不一致，当胶走的时候就会出现溴酚蓝走不平的现象，往往会走出一个＂哭脸＂的溴酚蓝，最后会导致胶下面紧缩．解决办法就是跑的时候电压稍小一点，以观察溴酚蓝走平为好．背景很深应该是你银染本身有问题吧．大分子量marker
sigma有卖．
sigma大分子量marker 的货号是多少？分子量范围在多大阿？
>
初学蓝绿胶的同学看看这篇文章比较好
BN-electrophoresis=_sdarticle.pdf (204.87k)
做线粒体bn-page时怎么样才能避免叶绿素的污染阿？含有叶绿素的线粒体会不会也能得到类囊体的蛋白质复合物阿？
那就要看你提到的线粒体的纯度了
我走胶时用的是17*17cm型号的板，一般用多大的电压才能较好的防止第二向电泳过程中泳道弯曲的情况？我前几天试过100v电压，跑了14个小时才跑完,结果还是出现了这种情况，急啊！！！！
不知道你１７*１７是第一向还是第二向，还是都是．其实没有必要用这么大的槽，不管是第一向还是第二向．泳道弯曲和电压有点关系，但是也不完全是这样的．
我对BN-PAGE，只是从文献里
知道有这么一回事，但没具体地研究过，看了上面的帖子，我有个想法不知可行吗，希望大家给与指导。我是研究植物雄性不育的，现在对雄性不育的理解大多数认为与线粒体有关，所以我觉得，能否将不育植株和可育植株的线粒体膜蛋白提取出来，跑个BN-PAGE
这个想法可以通过bn来看看，做一个比较的研究，但是bn只能来分析线粒体上那些蛋白复合物以及亚基，这些复合物是不是和你的研究相关，这个还是要通过文献来知道。另外，倒是可以通过普通的2d来看看蛋白表达的差异。
是的，我现在正做2d，只是觉得对bn比较感兴趣，好奇，这样我可以有一个思路
请问baiy老兄，你看过nature protocol 上Hermann
Schägger发的Tricine-SDS-PAGE没？３月１６号我在这个版快上问了一个问题：第二向胶的下面部分没有很多点．但没有人回答．这几天我反复看了文献，Tricine-SDS-PAGE上有一句话似乎给了我答案．Setting
the SDS/neutral detergent ratio to <10 may
result in a surprising result after staining: normally separated,
large proteins may
be detected in the upper gel areas, but the lower gel areas may be
completely clear with no small proteins
detectable.我第二向平衡SDS的浓度是１％．你平衡时sds的浓度是多少？这句话中所指的neutral detergent
是什么？是第一向处理样品时用的TX-100吗？望赐教．谢谢！
不知道你是想问单纯的tricine还是bn后tricine,照我的想法,如果你是单纯想看10kd以下的,那可以用tricine,如果小分子量的本身不是很多的话也sds就可以解决问题了.按照文献里的话triton是一种neutral
detergent ,但是是不是SDS/neutral detergent ratio to <10
里所说的我就不知道了,因为你的样品虽然用triton处理了,但是跑过bn后triton浓度是多少就不知道了,所以你只有降低平衡时sds的浓度再试试就知道了.
谢谢baiy老兄的回复.我是想问bn后跑tricine的情况.Setting the SDS/neutral detergent
ratio to <10 may result in a surprising result after staining:
normally separated, large proteins may be detected in the upper gel
areas, but the lower gel areas may be completely clear with no
small proteins
detectable.按照这句话的意思我觉得应该是升高平衡时sds的浓度才可以.文献上一般都是用的1%,但我试了很多次,每次总是下面没点.你觉得呢?
那你可以试试sds的浓度啊,不过如果是这样的话,你第二向可以直接做一个胶浓度大一点的sds-page,这样就可以确定样品里面有没有小分子量的了.
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(2012-10-31 19:20:44)