一个常用的技术，初学者使用时依然有些问题，先看一个网上的贴子：

    jiyi923 2006-08-27

    今天用考马斯亮蓝定量蛋白质，因为以前用酶标仪没有595nm的，所以今天特意用紫外分光光度计测了，595nm，0.7几，又换570测了0.6几，又换630测得0.8几；结果我又把一样的样本用96孔板在酶标仪上测，结果570nm只有0.2几，630也是0.2多，比570的大点；这数据也叉太远了吧！
用的是伯乐的酶标仪，样本是1ml染液，90ul水，10ul蛋白提取液。
    紫外分光光度计的牌子忘了。我想问问用这种方法定量蛋白质的大虾你们是用酶标仪的哪个波长测的阿？？OD值是多少阿？
    今天真是郁闷把裂解液弄脸上了，里面还有PMSF

    回答：

    考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰变为595nm。蛋白质含量在1-1000μg范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

    蛋白质-染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。

    考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

    该方法用于大多数蛋白质定量是相当精确的，特别是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污剂的浓度超过0.2%则影响定量结果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。

     Lambert－Beer定律：吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积呈正比。
    酶标仪和分光光度计的液层厚度不同，所以吸光度也不同，但是
    在一定波长下公式中K是一定的，样品浓度也一样，所以在相同波长下的酶标仪和分光光度计的吸光度的比值是一样的，
    比如分光光度计测得A570=0.6 A630=0.8
    酶标仪测得A'570=0.2，则可以算出A'630=0.2*0.8/0.6=0.267，A/A'=l/l'，分光光度计的l=1cm，则酶标仪的液层厚度l'=1*0.2/0.6=0.33cm

1. Bradford染液配制：将100mg考马斯亮蓝溶于50 ml 95%的乙醇中，加入100ml 浓磷酸，然后，用双蒸水补充至200ml，放4C至少6个月。

2. 作标准曲线的蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准蛋白，例如进行抗体定量，可用纯化的抗体作为标准蛋白。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg-150μg/100μl之间绘制标准曲线。

3. 将待测样本溶于100μl缓冲溶液中，该缓冲溶液应于作标准曲线的缓冲溶液相同；

4. 按1：5用双蒸水稀释浓染料结合溶液，过滤离心沉淀物；

5. 每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5-30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，即可在595nm光波长下测定其吸光度。注意，颜色反应不得超过30min；

6. 不能用beer定律进行计算，只能应用标准曲线计算待测样本的浓度。

紫外吸收法 

    紫外吸收法测蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

    因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。 
    但该法的缺点是：

   1. 对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收值也不同。据初步统计，浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。    

   2．若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液中有时混杂有核酸，应予以校正。当样品中含有核酸类杂质，可以根据核酸在260nm波长处有最强的紫外光吸收，而蛋白质在280nm处有最大的紫外光吸收的性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差 。

    紫外光谱标准曲线吸收法

    原理  本法根据蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光区的吸收特点而建立的。蛋白质在280nm波长附近有一吸收峰，其吸收程度与这些氨基酸的含量成正比。此法灵敏度高，可测到微克水平，操作简单，不需要加各种试剂，测完后，样品可回收。

   标准曲线的制备

    ⑴ 用精密天平称取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理盐水中。

    ⑵ 以生理盐水再稀释成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以盐水对照。

    ⑶ 测各管OD₂₈₀值。

    ⑷ 以OD₂₈₀值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

    3．样品测定

    将待测样品以盐水适当稀释，在0.10mg/ml~1.00mg/ml之间，以生理盐水为对照，测OD₂₈₀值，从标准曲线上查出蛋白含量。

紫外分光直接测定法

A1m＝13.8（IgG）(280nm)

A1m＝14.5(IgM)(280nm)

    公式一：

    蛋白质浓度（mg/ml）=1.45OD280－0.74OD260 

    此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。

    蛋白质紫外光吸光率是所有的蛋白质定量方法中最快的方法。通常在280nm光波长下读数。其在280nm光波长下的最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在。在205nm光波长的吸收也常用到。其在205nm光波长下的最大吸光率主要取决于肽链，尽管氨基酸也有影响。另外，一个主要的优点是在测定蛋白质浓度时，样本不会遭到损害。

1、纯蛋白质溶液：

① 在280nm光波长下读取与适当的对照相比较的吸光率；

② 对于抗体和BSA，可应用下表计算其浓度对其他蛋白质可粗约地估计：1个单位吸光率相当于1mg/ml。

蛋白质             A280 (1mg/ml)

IgG                  1.35

IgM                  1.2

BSA                 0.7

2、含有核苷酸的蛋白质溶液

①  在280nm和260nm或280nm和205nm光波长下读取与适当的对照相比较的吸光率；

② 用下列等式粗略计算其浓度：

        公式二： 蛋白质浓度（mg/ml）=(1.55×A280 )-(0.76×A260 )

        公式三： 蛋白质浓度（mg/ml）= A205 /(27 + 120 A280/ A205 )

    公式四： 

    通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量：

    蛋白质浓度（mg/mL）=F* A280*D*1/d

    其中A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值；d为石英比色皿的厚度（cm）;D为溶液的稀释倍数；F为校正因子。

    稀溶液中蛋白质浓度测定的经验公式：蛋白质的肽键在200—250nm有强的紫外吸收。其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其波长越短，光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差，因此，对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用215nm和225nm光吸收差法。

    吸收差d= a215 －a225
   （一）绘标准曲线

    以吸收差d为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
   本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，nacl、（nh4）2so4以及0.1m磷酸、硼酸和tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1n naoh, 0.1m乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005m以下才无显著影响。
   （二）常用下列经验公式：

    公式五：蛋白质浓度（mg/mL）=0.144（A215-A225）

    A215和A225分别为蛋白质溶液在215nm和225nm处测得的吸光度值

     280nm的光吸收法
    因蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
    测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值a280。蛋白质浓度可控制在0.1～1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，a280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的消光系数值（a1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（a1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值a1％1cm,称为百分吸收系数或比吸收系数。

    公式六：蛋白质浓度 = (a280′10 )/ a1％1cm,280nm (mg/ml)
                         (q 1%浓度，10mg/ml)
    例：牛血清清蛋白 ： a1％1cm=6.3 (280nm)
        溶菌酶 ：   a1％1cm=22.8 (280nm)
    若查不到待测蛋白质的a1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（bsa）。

    蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

    蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50～500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值a238，以a238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。
    进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。
    本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。