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质谱技术蛋白质定量方法

(2012-06-08 22:00:57)
标签：

同位素

标记

质谱

蛋白质

文化

 分类： 分子生物学专业
转载
基于质谱技术蛋白质定量方法的研究进展
朱金蕾1  张锴1*何锡文1 张玉奎1,2
1南开大学化学学院，天津市卫津路94号，300071
2中国科学院大连化学物理研究所，辽宁省大连市中山路457号，116023
摘要   质谱技术已经成为目前蛋白质鉴定的重要工具。定量分析细胞内蛋白质组的动态变化，是当前研究蛋白质功能、揭示细胞生物机理、寻找疾病蛋白标记物和药物靶标的迫切需要。本文综述了基于质谱技术蛋白质定量的策略、方法和应用等方面近年来的进展，评述了几种蛋白质质谱定量方法的特点和应用潜力。
关键词   质谱，蛋白质组学，定量，同位素标记
 
1 引 言
细胞内蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程有重要影响，当前蛋白质组的定量分析研究已经引起广泛关注，这为分析化学带来了新的挑战和机遇，基于质谱的蛋白质分析技术也从蛋白质组的鉴定发展到定量蛋白质组学(quantitative proteomics) 研究[1,2]。目前定量蛋白质组学的方法主要是利用同位素标记结合质谱分析完成的，本文就基于质谱蛋白质定量技术的新进展进行评述。
2 凝胶电泳定量方法
凝胶电泳法(gel electrophoresis)是传统的蛋白质分析方法[3]。凝胶电泳与质谱技术的结合使其应用更加广泛[4]。随着新的染色试剂的出现，使得凝胶电泳技术有了新的发展。例如Schulenberg发现了一种小分子的荧光染料(Pro-Q Diamond dye)可对磷酸化蛋白质特异性染色，经凝胶电泳分离、MALDI-TOF质谱鉴定，发现了复杂生物样本体内新的磷酸化蛋白[5,6]。
传统凝胶电泳技术定量蛋白质快速简单，但存在诸多困难，例如难以检测疏水的膜蛋白、低丰度蛋白，以及一些极酸和极碱性的蛋白；染色方法的动态范围最多只能达到3个数量级，不能满足实际样品的定量要求。
3 同位素标记的质谱定量方法
3.1 同位素代谢标记法
同位素代谢标记以同位素元素或同位素标记氨基酸形式掺入到细胞培养基中，在细胞生长代谢过程中完成蛋白质同位素标记。Oda等[7]在酵母细胞培养基中掺入15N作了初步尝试。Mann的研究小组发展了一种以氨基酸形式掺入的同位素代谢标记法[8,9](SILAC, stable isotope labeling by amino acids in cell culture)。其基本原理(图1)：分别用轻型和重型同位素标记必需氨基酸，作为不同方法处理的细胞培养基原料，经多次细胞倍增周期和代谢过程，重型同位素标记的氨基酸完全转移到细胞新合成的蛋白质中。不同标记的蛋白按照一定比例混合后，一同处理，经分离纯化后，进行质谱鉴定和定量。通过对氨基酸序列相同、不同同位素标记肽段丰度的比较，可以得到细胞内各种蛋白在不同处理过程中表达的定量关系。
质谱技术蛋白质定量方法

图1 SILAC法标记13C6-Lys基本原理
 
SILAC法最初是标记哺乳动物的培养基细胞[8]，后来渐渐发展到标记细菌[10]、酵母[11]、植物细胞[12]。近来，SILAC标记法结合液质联用技术已在解决生命科学疑难问题方面显示作用，例如，对酵母信息素和干细胞分化过程中磷酸化蛋白的定量，蛋白质之间合成与降解的分析等[13]。SILAC法不但可以用于检测特殊的功能蛋白质在某些生物过程中的动态变化[14~16]，而且可以用来描述大脑组织中整体蛋白质组的蓝图[17]。

        SILAC法与多种质谱技术相结合应用广泛。2008年，Kruger[18]等结合线性离子阱傅立叶变换高磁质谱（LTQ-FT）将SILAC方法拓展应用于哺乳动物体内，并以三种基因表达缺陷的小鼠为模型进行差异性标记，明确证实了相关组织中相应蛋白质的表达缺失信息。Mann[19]小组将SILAC法结合高分辨LTQ-Orbitrap质谱应用于鼠科胚胎干细胞研究，成功鉴定并定量出胚胎干细胞中的5111种蛋白质，这个数量是以往分析结果的三倍。Olsen等[20]采用SILAC法标记结合LTQ-FT质谱定量研究了HeLa 细胞在表皮生长因子刺激后的蛋白变化，检测到2244个磷酸化蛋白上的6600 个磷酸化位点，其中14%的磷酸化位点在EGF 刺激后有2 倍以上的差异，揭示了HeLa 细胞中的磷酸化蛋白受EGF 影响的一个动态过程。Uitto等[21]运用SILAC法结合基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）定量研究了卵巢癌细胞系中的蛋白表达水平，发现SILAC法具有较高的重现性。

        就SILAC的机理而言，以氨基酸为原料的细胞培养基，均可用SILAC法标记(目前多采用精氨酸和赖氨酸标记)。从目前的文献报道来看，SILAC法弥补了质谱在定量方面的局限，与分析和生化处理过程具有很好的兼容性， SILAC法标记效率高、损失小；标记误差低，可靠性高。其不足之处在于：一是只适用于活体培养的细胞，对于生物医学研究中常用的组织、体液等样品难以处理，二是对于动物模型的标记成本太高(表1)。但是，SILAC结合HPLC/MS/MS技术已发展为当前生物医学精确定量蛋白质的最有效方法之一。  

表1 蛋白质相对定量方法的比较

 

凝胶电泳法
 
无
无
快速简单，易观测，成本较低。
灵敏度低，难以检测疏水性膜蛋白、低丰度蛋白。
[3] [4]
同位素代谢标记法
12C (13C)
14N(15N)
1H (D)
体内标记
标记效率高，误差低，没有放射性。
仅适用于活体培养细胞，成本较高。
[8] [9][13]
同位素亲和标签法
1H (D)
12C (13C)
体外标记
适于多种类型的样品。
仅适用于含半胱氨酸的蛋白分析，数据检索复杂。
[22][23]
酶催化18O同位素标记法
16O (18O)
体外标记
操作简单，副产物少，适于低丰度磷酸化肽段的分析。
受酶解过程和条件影响较大， 18O原子掺入个数具有不确定性。
[38][43~45]
同重同位素标签标记定量法
12C (13C)
14N(15N)
16O (18O)
体外标记
可同时标记四种不同样品，蛋白覆盖率高，定量准确，可信度高。
样品预处理和酶解过程可能引起平行样品之间有差别，造成结果偏差；成本较高。
[46][53]
非标定量法
 
无
无
简单易行，无需同位素标记过程。
仅依据一级质谱和数据模型定量，重现性差，定量不准确；难以检测低丰度肽段。
[

3.2 同位素化学标记法

3.2.1 同位素亲和标签法
同位素化学标记法是通过与氨基酸的功能团发生特殊的化学键合反应，将同位素标记物引入蛋白进行定量分析的一种体外标记方法。Gygi等[22]开发的同位素亲和标签 ICAT(isotope coded affinity tags)是目前应用较广泛的化学衍生标记试剂。ICAT试剂主要由三部分构成(图2A)：(1)亲和标签，用于ICAT标记多肽的提纯过程；(2)连接子，用来整合稳定的同位素；(3)活性集团，用来特异结合巯基(半胱氨酸)。ICAT标记法的原理(图2B)：首先，将不同状态的细胞裂解，分别加入不同标记的ICAT试剂，反应后按照一定比例混合，然后将纯化的蛋白组一起酶解，进行HPLC/MS/MS分析，可以定量分析不同状态的细胞内蛋白的丰度变化[23]。
质谱技术蛋白质定量方法
ICAT标记法不但可以用来分析整个细胞蛋白质的表达变化[24]，而且可对一些专门的亚细胞组分蛋白质做定量研究，诸如染色质[25]、线粒体[26,27]和脂筏[28]等。
ICAT法与各类质谱的联用也很广泛。例如采用ICAT法结合四极杆-飞行时间串联质谱（Q-TOF）对平滑肌细胞脂筏蛋白[29]、硫氧化还原蛋白Trx(thioredoxin)[30] 进行的定量研究。Fu等[31]用ICAT技术结合MALDI-TOF/TOF质谱，鉴定出心脏组织中63种氧化还原敏感性蛋白，为进一步研究氧化还原介导对细胞调控的过程提供了广阔前景。最近，Lynn等[32]利用ICAT试剂借助LCQ离子阱质谱，对有关老年痴呆症发病机理的线粒体蛋白进行了定量分析，并对影响因子早衰素 (presenilin-1)作了进一步探讨。Prahalad等[33]采用ICAT标签结合LTQ质谱对骨髓单个核细胞(BMMNC)、骨髓混合细胞产物(BMMCP)中的蛋白进行鉴定定量，鉴定出638 种BMMNC蛋白，867种BMMCP蛋白。Yang等[34]利用ICAT试剂结合LTQ-Orbitrap质谱鉴定出37种蛋白在E.sakazakii杆菌中表达异常，并与2-DE结合MALDI-TOF质谱的鉴定结果进行比较，指出两种方法各有优势又相互补充。
从ICAT标记技术的文献报道来看，ICAT法适合多种类型样品，如体液、活体组织等。但是ICAT 试剂存在一些不足：一是不能分析半胱氨酸缺失的蛋白质；二是ICAT试剂分子量约为500Da，这会增加数据库搜索的复杂性，为此，出现了可剪切ICAT试剂(cleavable isotope coded affinity tags, cICAT)[35,36]，用可被酸剪切的官能团代替ICAT试剂中的聚醚链接减少了难以解析的碎片离子数量； 9个13C取代8个氘原子，使轻、重同位素试剂质量相差9Da提高了质谱分辨率。Gygi等[36]运用cICAT试剂研究了盐度胁迫(salinity stress)对酵母细胞蛋白表达情况的影响，鉴定并定量出560种蛋白。基于ICAT试剂或cICAT试剂合成成本太高, Guaragna等[37]合成了BAA-ICAT(beta-alanine-arm-ICAT)试剂，合成流程简单方便，残基稳定易检测。
3.2.2 酶催化18O-同位素标记法
该方法是通过加入H218O，在蛋白酶催化作用下将羧基上的2 个16O替换成18O，使肽段质量数相差4Da[38]。18O标记过程大致可分为两种：酶切过程中标记和酶切后标记，前者的酶切和标记反应在同一个反应体系中同时进行, 而后者把酶切和标记反应的体系分开，酶切和标记条件可以分别优化，在复杂样本的标记中应用广泛[39,40]。

 

18O标记法也可与多种质谱配合使用。Fenselau等[41] 应用18O标记结合FT-ICR质谱技术研究了腺病毒蛋白的相对表达水平，利用Q-TOF质谱进行单个碎片离子扫描，鉴定出腺病毒蛋白上的一些修饰位点、氨基酸序列等。Korbel等[42]采用18O标记和Q-TOF质谱结合免疫共沉淀反应来分析红细胞生成素(erythropoietin, EPO)受体依赖的蛋白质，鉴定了187个磷酸化蛋白，并定量分析了89个酪氨酸磷酸化修饰与EPO受体依赖性的动态关系。Sui等[43]建立了一种18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白定量技术，实现了HepG2细胞中磷酸化肽段的有效定性和定量。Sakai等[38]结合LCQ质谱将18O标记法和ICAT法对比，发现18O标记法较ICAT法分辨率高、同位素效应小。

从18O同位素标记法相关研究发现，用18O进行同位素标记会产生标记一个氧原子和两个氧原子不等的现象，为此，Liu [44]等研究了一种双重18O标记方法，使用二乙三胺五乙酸双酸酐(DTPA)修饰多肽N端，使其在MALDI-TOF/TOF二级质谱分析时只产生y-系列离子，具有很好的检测灵敏度和准确性。Qian等[45]对影响18O标记的实验条件进行了优化，发现除C-末端肽段外绝大多数肽段可达到100%标记，并得出16O/18O 成对肽段峰强度在10倍动态范围内标记率的RSD<18.4%。综上所述，18O 标记技术操作简单，反应条件温和副产物少，便于与磷酸化肽段富集方法联用，适于低丰度磷酸化肽段的定量标记。
3.2.3 同重同位素标签标记定量法
同重同位素标签标记定量法(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)是一种对氨基酸N端和赖氨酸残基进行酶解后同位素标记的技术[46]。iTRAQ试剂包括三部分(图3)：报告基团、平衡基团和肽反应基团。不同的报告基团(分子量分别为114Da, 115Da, 116Da, 117Da)分别与相应的平衡基团(分子量分别为31Da, 30Da, 29Da, 28Da)相配，保证总分子量为145Da。肽反应基团将iTRAQ标签与肽段的N-端基团和每个赖氨酸侧链相连，可标记所有酶解肽段。HPLC/MS/MS分析后，根据母离子的MS/MS可以鉴定出四个子离子峰，由相应的报告基团离子的质谱峰强度可以推算出四种肽段的相对浓度。
质谱技术蛋白质定量方法
已报道的文献中，iTRAQ标记法多与TOF质谱联用。Fisher 等[47]用iTRAQ标记法结合MALDI-TOF/TOF质谱技术对唾液中的内源性多肽进行了定量分析，考察了采集时间对多肽丰度的影响。Zhang等[48]将iTRAQ技术与Q-TOF技术结合，定量分析了表皮生长因子受体蛋白上酪氨酸的磷酸化位点，鉴定出58种蛋白上78个酪氨酸磷酸化位点，在此基础上又鉴定了26个酪氨酸磷酸化位点和18种蛋白。Bouchal等[49]基于iTRAQ标记法和QqTOF质谱技术平台，重现性的鉴定了乳腺癌活体组织切片的605种非冗余蛋白。最近还发展了iTRAQ标记法与LTQ、LTQ-Orbitrap质谱的联合使用，并应用于人成纤维细胞中磷酸化蛋白的鉴定和定量[50~52]。
从分析结果可知，iTRAQ 试剂标记了几乎所有的肽段，提高了蛋白鉴定的覆盖率，增加了鉴定和定量的可信度；但是，该方法在酶解处理过程中的不一致性，可能会造成平行样本进入质谱检测时有较大误差[53]。
4 非标定量法
非标定量法(label-free)是通过比较质谱分析次数或质谱峰强度，来分析不同来源样品蛋白的数量变化。在目前广泛使用的HPLC/MS/MS data-dependent分析技术中，多肽的质谱分析次数与蛋白的丰度具有相关性，包括蛋白的肽段序列覆盖率(sequence coverage)[54]、肽段匹配数 (peptide hits)[55]、PMSS 模型(peptide match score summation)[56]、emPAI(exponentially modified PAI)[57]等参数模型。由于上述模型都是基于肽段水平的定量，因而会受到肽段本身性质在质谱分析过程的影响，肽段离子化或碎裂的容易程度会影响肽段的检测丰度，对较低丰度的肽段难以检测分析，这些问题会影响定量的真实性。
质谱峰强度定量是用一级质谱峰强度作为蛋白或肽段丰度的标示信息。目前已经有不少软件用了这类方法[58]。但由于不同软件往往是采用不同的算法来实现以上步骤，至今这些方法没有统一的可靠性评价。
Erba[59]等采用label-free策略和MALDI-Q-TOF技术在定量分析表皮生长因子的磷酸化蛋白动力学、蛋白质覆盖率、序列鉴定、识别磷酸化位点等方面取得了新进展。Wang[60]等采用非标定量方法分别结合LCQ、LTQ-FT质谱对多种样品的重现性作了测试，并详细研究分析了蛋白质的磷酸化过程。最近，我们借助LTQ质谱和PTMap软件，鉴定出酵母菌组蛋白上新的丙酰化和丁酰化修饰，并发现了14种潜在的、未知的蛋白修饰[61]。
尽管同位素标记已经成为可信赖的定量方法，但准备同位素化合物需大量时间，并且试剂昂贵。无标记方法没有这些问题，但此技术仍然不够精确，目前只有利用蛋白的一级质谱峰强度和蛋白的肽段质谱数据模型的方法，无标记方法对HPLC/MS/MS实验的重复性有很大的依赖性。
5 展 望
从以上评述可以看出，几种蛋白质相对定量各有特点和不足(如表1所示)。目前，蛋白质相对定量方法仍在不断取得进展，特别是在标记试剂和分析软件领域。试剂方面如荧光同位素亲和标签FCAT(fluorescent isotope-coded affinity tag) [62,63]，金属螯合亲和标签MeCAT(metal-coded affinity tag)[64]；软件方面，例如新的数据处理软件MaxQuant，该软件能专门定量蛋白组，并为蛋白质功能研究提供了相关生物信息资料[65]。这些技术将在蛋白质定量方面发挥重要作用。
近年来，蛋白质绝对定量的研究也引起分析化学家和生物医学界的关注，对蛋白质的绝对定量研究，可以使我们更了解蛋白的性质，全面理解蛋白质在功能网络中的作用；而且通过对一些标志性蛋白在不同时期绝对量的监测,更有利于直观地判断某些疾病的发生和发展。目前，蛋白质绝对定量主要是基于内标法的同位素标记策略。例如，同位素标记的肽段作为内标的AQUA法(absolute quantification of abundance) [66,67]，人工合成QconCAT蛋白法[68~70]，同位素标记的氨基酸作为内标的蛋白质绝对定量法[71]。此外，还有测定蛋白质中磷或硫元素的ICP-MS绝对定量法[72]。从目前的研究报道来看，绝对定量主要是针对一个或几个感兴趣的蛋白进行，大规模化定量还有困难，而且由于肽段响应信号不同、色谱分离行为不同、内标肽段合成困难、质谱分析软件评价标准不同等因素也制约着蛋白质绝对定量的发展。因此，蛋白质的绝对定量应探索与色谱、质谱更兼容的方法，注重大规模蛋白质的绝对定量研究。
定量蛋白质分析是当前分析化学和蛋白质分析的热点之一。将同位素标记引入活体细胞样本，并与质谱分析有机结合，不仅解决了质谱定量分析的不足，同时也为精确观测细胞蛋白组在不同生理条件下相对丰度的动态变化提供了有力工具。随着蛋白质定量技术在生物医学和临床研究中的应用，生物质谱技术在生物医学应用方面将显示更大的潜力。

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