实验一:培养基的配制

一．实验内容:

1.基础培养基的配制:

  液体培养基:10支/小组(约5mL/支)

  半固体培养基: 10支/小组(约5mL/支),

  斜面培养基: 10支/小组(约5mL/支),

  平板: 10块/小组(约20mL/块)

2.生化反应试验用培养基:

  葡萄糖蛋白胨水培养基:8支/小组

  蛋白胨水培养基:4支/小组

  枸椽酸盐培养基： 4支/小组

  葡萄糖发酵管(内置小倒管):4支/小组

  乳糖发酵管(内置小倒管): 4支/小组        

3.做棉球：10个/人

4.包扎平皿10/组         

二．实验材料及配制方法

（一）实验材料

1.培养基配料:蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂 蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、枸椽酸盐培养基

2、试剂：NaOH溶液(1mol/L); HCl溶液(1mol/L)

3、其他：精密PH试纸、点滴板， 250mL三角瓶1个，量筒（100mL）1个、15X150mm试管54支，试管塞54个，三角瓶塞1个，烧杯(500mL)1个,培养基分装装置一套,平皿10个,玻捧、报纸，棉线（包扎用）。

（二）配制方法

1．基础培养基的配制：

     先配液体培养基400mL；取出其中约50mL，分装成10支试管(5mL/支)，制成液体培养基；再取出约50mL,加入琼脂0.15g,加热溶解后，分装成10支试管，制成半固体培养基；剩余300mL，加入琼脂9g，加热溶解，配成固体培养基，取出其中约50mL，分装成10支试管，配成斜面培养基；剩余约250mL，用三角瓶装后包扎，用于配制平板。

2．生化试验用培养基：按说明书配制

三．具体操作步骤

（一）液体培养基的配制：

1、配料：准确称取蛋白胨4g，牛肉膏2 g，氯化钠2g 量取自来水400mL.

2、加热溶解：将已称量好的上述固体配料置于500mL烧杯中，加适量水，电炉加热使各成份完全溶解，边加边搅拌,注意培养基不能溢出!加水补足至400mL

3、过滤：如果培养液有沉渣或浑浊，则用多层纱布过滤，使培养基澄清透明。

4、调PH值：用精密PH试纸或酸度计测试培养液PH值，并用1mol/L的NaOH溶液校正至PH7.6

5、分装: 取上述已溶解的液体培养基50mL，分装至10个试管中，5mL/支。

6、包扎：塞上合适的试管塞，用两层报纸包扎

（二）半固体培养基的配制：

从已配好的液体培养基中取出50mL，加入0.15 g琼脂，加热溶解，调PH值，分装至10个试管中（5mL/支），加塞包扎。

（三）固体培养基的配制：

已配好的液体培养基300mL，加入9 g琼脂，加热溶解，调PH值

1.斜面培养基的分装：

将已配好的固体培养基分装至10个试管中（5mL/支），加塞包扎。

2.平板培养基的分装：

将剩余的固体培养基装入250mL的三角瓶中，加塞，包扎。灭菌后倾注平板

（四）生化反应用培养基的配制

1.葡萄糖（乳糖）发酵管：蛋白胨1g，氯化钠0.5g，葡萄糖（乳糖）0.5g，蒸馏水100mL，1.6%溴甲酚紫1mL，加热溶解后，分装于含杜氏小管的试管中

2.葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨0 .7g   磷酸氢二钾0.38g   葡萄糖0.5g  蒸馏水100mL，加热溶解后，分装于试管中

3.蛋白胨水培养基:蛋白胨：1g氯化钠0.5g，蒸馏水100mL，加热溶解后，分装于试管中

4.枸橼酸盐培养基：枸橼酸钠2g，氯化钠5g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾0.8g，磷酸二氢铵1g，0.5%溴麝香草酚蓝20mL，琼脂15-20g，蒸汽水1000mL 加热溶解后，分装于试管中

 

实验二  实验用品高压灭菌

一、实验目的

掌握高压蒸汽灭菌的原理。使用方法，使用程序

二、需灭菌的物品和灭菌用的材料

已装有培养液的三角浇瓶，生化反应培养基，平板，吸管，平板

材料：报纸，绳子

三、具体操作方法

1、取出报纸，将三角烧瓶的口端包好，用绳子包扎好。

2、将装生化反应培养液试管包好其试管头部，用绳子包扎好。

3、把平板分成两组，每组5块，分别用报纸包好，并且包好吸管。

4、在高压蒸汽灭菌器底层加水，将以上要灭菌的物品放置于内层的金属圆珠笔桶内。

5、加上盖子扭紧螺旋，加热，待客器内压力达5kpa时，打开排气阀门放冷气，待压力下降至零时，关闭排气阀门，继续加热至103.42kpa。

6、调节热源，使压力维持20——30min，灭菌时间到达后，停止加热。

7、待压力自行下降至零时，开盖取出灭菌物品。

实验三  细菌的接种与培养

一﹑实验目的

1﹑学会正确使用常用的细菌接种工具，掌握细菌接种技术。

2﹑熟悉细菌在不同培养中的生长现象。

3﹑掌握无菌操作技术。

二﹑实验材料

1﹑菌种：大肠杆菌﹑枯草杆菌﹑金黄色葡萄杆菌﹑绿脓杆菌

2﹑培养基：液体培养基生长现象﹑半固体培养基生长现象﹑斜面培养基生长现象。

3﹑其他：接种环﹑酒精灯﹑火柴。

三﹑实验步骤和方法

1、液体培养基的接种：

方法：（1）用灭菌接种环挑取菌落或标本。

（2）在试管内壁与液面交界处轻轻研磨，使细菌均匀得散落在液体培养基中。

2、半固体培养基的接种：

方法：（穿刺接种）在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。

3、斜面培养基的接种：

方法：（1）用左手握住菌种管和斜面培养基底部，右手持接种环或接种针。

（2）用右手小指与手掌、小指与无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰、灭菌。

（3）用接种环或接种针伸入菌种管内，挑取用来移种的菌落。

（4）伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线，或直接自下而上地蜿蜒划线。

（5）接种完成之后，用火焰灭菌培养管口，并塞上棉塞，置于37℃培养。

    图1 斜面接种               图2  液体培养基接种法

4、平板划线分离：

方法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（如下图）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。

平板划线分离

 

5细菌生化反应接种：

1、将大肠杆菌、伤寒杆菌、志贺氏菌、变形杆菌分别接种于葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基

2、将大肠杆菌、伤寒杆菌、志贺氏菌、变形杆菌分别接种于2支葡萄糖蛋白胨水培养基，1支缓冲蛋白胨水培养基，1支枸橼酸盐培养基做IMVC试验。

6无菌操作技术：

斜面接种时的无菌操作

 

 

 

实验四：细菌生长现象观察、生化反应试验

一、内容：

1、观察并记录细菌生长现象

2、生化反应试验结果观察并记录结果

二、实验材料

菌种：大肠杆菌、变形杆菌

培养基：已接种的大肠杆菌培养基、金黄色葡萄球菌培养基、枯草芽孢杆菌培养基、绿脓杆菌培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、枸橼酸盐琼脂斜面培养基、乳糖发酵管、葡萄糖发酵管

试剂：甲基红试剂、40%氢氧化钾溶液、6%a-萘酚酒精溶液、吲哚试剂

其他：接种环、酒精灯等

三、实验步骤及操作方法

（一）单糖发酵试验

1.观察未接种细菌的正常单糖发酵管的状况

2.接种3.培养4.观察5.记录

（二）甲基红实验

1.接种2.培养3.加一滴甲基红试剂4.观察5.记录

（三）V-P实验

1.接种2.培养3滴加40%氢氧化钾溶液10-20滴4.摇匀5.再滴加等量的a-萘酚溶液6.静置15分钟7.观察8.记录

（四）吲哚实验

1.接种2.培养3.加吲哚试剂2-3滴4.摇匀5.静置6.观察7.记录

（五）枸橼酸盐利用实验

1.接种2.培养3.观察

四、结果记录与分析方法

细菌	液体培养基生长现象	半固体培养基生长现象	结果记录	斜面培养基生长现象
大肠杆菌	混浊	羽毛状		菌苔
金黄色葡萄球菌	沉淀	透明		菌苔
枯草芽孢杆菌	菌膜	羽毛状		菌苔
绿脓杆菌	沉淀	羽毛状		菌苔

细菌菌落特征

细菌	大小	形态	隆起程度	表面质地光泽	边缘	湿润度	透明度	色素
大肠杆菌	不一	圆形	扁平	光滑	整齐	湿	透明或半透明	白色
金黄色葡萄球菌	不一	圆形	凸起	干燥		湿	不透明	灰黑
枯草芽孢杆菌	不一	球形	皱醭	粗糙			不透明	微黄色
绿脓杆菌	不一	圆形	微隆起	光滑	不齐	湿	不透明	黄绿色

细菌生化反应试验结果

	葡萄糖发酵	乳糖发酵	吲哚试验	甲基红	V-P	枸椽酸盐试验
变形杆菌	混浊、黄色、气泡	混浊、黄色、无气泡	黄色	桔黄色	红色化合物	深蓝色
大肠杆菌	混浊、黄色、气泡	混浊、黄色、气泡	玫瑰红色	红色	无红色化合物	绿色

 

 

 

实验六 细菌形态观察技术

1．观察前的准备

（1）置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为一寸左右。镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。显微镜构造见右图。

（2）显微镜是光学精密仪器，在使用时要特别小心，使用前要熟悉显微镜的结构和性能，检查各总零件是否完好无损。镜身有无灰尘，镜头是否清洁，做好必要的清洁和调整工作。

（3）调节光源 对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛。晴天可直接用窗外的散射光，如明暗天气，可用8－30W日光灯或显微镜灯照明

调节光源及光照的一般步骤：

将低倍物镜旋至镜筒下方，旋转粗调节轮，使镜头和载物台距离约为0.5cm左右。

上升聚光器，使与载物台表面同样高。否则使用油镜时光线较暗。

左眼看目镜，调节反光镜镜面角度（反光镜有凹平两面，光线较强自然光源，宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源，宜用凹面镜。）对光使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线．

2．低倍镜观察。

检查的标本须先用低信镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。

（1）先将标本玻片置于载物台上，并将标本部位处于物镜的正下方，转动粗调节轮，下降物镜或上升载物台使物镜至标本0.5cm处。

（2）左眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调节轮，当在视野内出现物象后，改用细调节轮，上下微微转动，直至视野内获得清晰的物象。然后认真观察标本各部位，确定并将需进一步要观察的部位移视野中央，准备用高倍镜观察。

3．高倍镜观察；

将高倍镜转正至正下方，在转换接物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后由接目镜观察，再仔细调节光圈和聚光镜，使光线的明亮度适宜，同时再仔细正反两方向微转动细调节轮，直至获得清晰的物象后为止，找到最适宜于观察的部位。需进一步要观察的部位移视野中央，准备用油镜观察。

4．油镜观察：

（1）上升聚光器，全开虹彩光圈

（2）用粗调节轮提起镜筒或下降载物台，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。右手顺时针方向慢慢转动粗调节轮使镜筒下降或载物台上升，与此同时，从显微镜的侧面观察使油镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止。注意不要压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头。

（3）从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节轮将镜筒徐徐上升或将载物台徐徐下降，直到视野内出现物像为止，然后用细调节轮校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物象，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物象看清为止。

5．换片

观察完一个标本后，如果想要再观察另一标本时，需先将高倍物镜（或油竟镜）转回到低倍物镜，取出标本，按放片的方法换上新片，即可观察。千万不可在高倍物镜（或油竟镜）下换片，以防损坏镜头

 细菌形态观察

一、实验目的和内容

目的：巩固油镜的使用；掌握细菌形态观察的基本方法，了解细菌的基本形态。

内容：1．观察细菌的基本形态染色装片。

2．观察枯草芽孢杆菌活菌。

3．观察细菌细胞结构的染色装片。

二、实验材料和用具

溶血链球菌(Streptococcus haemolyticus )、棒杆菌(Corymebacterium)、螺菌(Spirillum)、浮游球衣菌(Sphaerotilus natans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium )、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis )、普通变形菌(Proteus vulgaris)、丙酮丁醇梭菌(Clostridum acetotylicum)、褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum )等细菌的染色装片，枯草芽泡杆菌(Bacillus subis)的斜面菌种。

 香柏油、二甲苯、无菌水；

 显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸水纸、小滴管。

三、操作步骤

 (一)观察细菌的基本形态

用低倍镜、高倍镜和油镜观察溶血链球菌、棒杆菌、螺菌、浮游球衣菌的染色装片，并分别在油镜下绘图。

 (二)观察细菌的细胞结构

用低倍镜、高倍镜和油镜观察巨大芽孢杆菌(示细胞壁)、巨大芽孢杆菌(示异染粒)、苏云金芽孢杆菌(示伴胞晶体)、普通变形菌(示鞭毛)、丙酮丁醇梭菌(示芽孢)、褐球固氮菌(示荚膜)等细菌的染色装片，并分别在油镜下绘图。

(三)观察枯草杆菌活菌，常用压滴法观察。 

1．将洁净无油腻的载片放于自己右边前方，在中央放一小滴无菌水。

2．将酒精灯放于自己正前方，点燃。

3．用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。

4．用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。如菌液过多，可用吸水纸适当吸去一部分。

5．先用低倍镜然后转用高倍镜观察，观察时光线要适当调暗些。

四、注意事项

1．注意擦镜头时，只能用擦镜纸。

2，观察完毕，必须将镜筒上升，才能取下装片，放入另一装片后，要按使用油镜要求，重新操作，不能在油镜下直接取下和替换装片，切记！

3．无菌操作过程中，接种环灭菌后不能触及其他物品，挑菌不能过多。