加载中…转染实验常见问题汇总
(2013-08-28 09:42:44)
标签：
转染文化 |
分类： 点滴知识 |
注：产品为罗氏相关
Q：转染效率低的可能原因和操作建议？
A：核酸质量问题，或核酸定量不准确：电泳检测核酸的完整性，并确保核酸的A260/A280>1.8。
细胞密度太低，或转染复合物用量太高：这两者有密不可分的关系。通常对于贴壁细胞来说，转染时细胞汇合度应达到70-90%，具体的密度还需根据不同的细胞系特征进行优化。如果转染实验使用了较低的细胞铺板密度，则转染复合物用量也需减少，如进行常规复合物用量的75%、50%和25%的梯度试验优化。
转染时细胞密度过高，或细胞生长状态不佳。
对转染试剂：DNA的复合物形成比例和复合物孵育时间进行优化。注意将加入稀释液的DNA和转染试剂完全混合（建议漩涡短暂混匀）。
使用无血清或减血清培养基稀释转染试剂和DNA，勿加入其它组分，如抗生素、生长因子、硫酸葡聚糖等。
实验中是否使用了合适的细胞培养基？细胞培养基需新鲜制备。
细胞被污染，如其它细胞系或支原体污染。
Q：细胞毒性大的可能原因和操作建议
A：由于操作原因或培养基原因导致的细胞状态不佳。使用不添加转染试剂和核酸的对照孔能帮助发现这些问题。注意质粒提取不纯也可能造成细胞毒性。
目标蛋白的高表达量对细胞造成的负荷过高，也可能导致细胞生长缓慢或活性降低。此时，可以在培养基中添加营养物质，或及时更换新鲜培养基。如果镜检观察到的细胞形态学发生变化，或细胞碎片太多，大部分情况下是由于细胞毒性引起，而非过量蛋白生产引起。
如果怀疑表达的蛋白会对细胞产生毒性，可以使用一种验证载体，如表达SEAP的载体进行平行转染实验，SEAP蛋白一般对细胞没有毒性。
抗生素引起的细胞毒性：首先确认在稳定转染的细胞株筛选时是否使用了载体抗性基因相应的抗生素。抗生素加入的浓度可能过高，或时间过早。
转染复合物稀释培养基造成的细胞毒性：DMEM培养基对某些昆虫细胞系有毒性，对于这些敏感细胞系，可以使用该类细胞的生长培养基（去血清/葡聚糖）稀释转染试剂和DNA。
对于接种的细胞密度来说，使用了过量的转染复合物。尝试不同的细胞接种密度、转染复合物比例、转染复合物用量，和转染复合物加入后的培养基换液时间，以降低转染试剂的细胞毒性。
细胞培养物被支原体污染。
Q：转染实验重复性差的可能原因和操作建议
A：在进行微量移液时的移液误差：转染试剂和DNA溶液的移液体积很小，微小的误差也可能造成实验结果很大的变化。
转染试剂和DNA的复合物制备时未充分混匀。
细胞传代数的影响：细胞经多次传代后，无论是基因型还是表型都会逐渐产生变化。勿使用传代次数过多的细胞。
Q：同时转染两种质粒，如何确定复合物中的转染试剂和质粒用量？实验时有什么需要注意的？
A：如果您需要进行两种质粒的共转染，建议对每种质粒的使用量进行矩阵试验优化。
使用X-tremeGENE
Q：转染中如何进一步降低细胞毒性
A：如果您在进行转染试验时，使用的是无血清培养基，在转染后培养细胞4个小时后，更换含血清的培养基，能降低细胞毒性，同时不会影响到转染效率。
Q：如何增加病毒颗粒产量
A：高转染效率和高蛋白表达会对细胞造成高负荷，影响细胞的生理状态，导致病毒颗粒产量降低。在此情况下，建议降低转染过程中转染复合物的用量。
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